Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О
ЭТИОЛОГИИ И ПАТОГЕНЕЗЕ САХАРНОГО ДИАБЕТА 1 ТИПА 10
1.1 КЛАССИФШ<АЦИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА 10
Определение и описание сахарного диабета 10
Сахарный диабет 1 типа 12
1.2 ЭТИОЛОГИЯ СД 1 ТИПА 13
Генетические факторы 13
Факторы внешней среды 13
1.3 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ СД 1 ТИПА 15
Географическая вариабельность частоты СД 1 типа 15
Временные и сезонные изменения частоты СД 1 типа 16
Популяционно-генетический аспект вариабельности частоты СД 1 типа 17
1.4 ПАТОГЕНЕЗ СД 1 ТИПА 19
Стадии развития сахарного диабета 1 типа 19
Механизмы деструкции b-клеток поджелудочной железы 20
1.5 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РАЗВИТИЯ СД 1 ТИПА 22
1.5.1 Влияние генетических факторов на развитие СД 1 типа 22
НЬА-О1^1,НЕА-ВдА1,НЬА-В0В1иСД1типа 24
HLA-DPB1 и СД 1 типа 25
HLA-LMP2 и СД 1 типа 26
HLA-DM и СД 1 типа 27
1.5.2 Полиморфизм одиночных нуклеотидов и генетическая
предрасположенность к развитию заболеваний 28
Замены одиночных нуклеотидов в гене TNF (-238 g/A и -308 g/A) 29
Замена одиночного нуклеотида в гене IFNG (+874 Т/А) 30
Замена одиночного нуклеотида в гене PTPN22 (+1858 С/Т) 31
Замена одиночного нуклеотида в гене CTLA4 (+49 A/g) 32
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2.1 СВЕДЕНИЯ ОБ ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ 35
ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ 35
SNP-ГЕНОТИГГИРОВАНИЕ 36
СЕКВЕСТРОВАНИЕ ПО СЭНГЕРУ 39
СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 42
ИСПОЛЬЗОВАННОЕ В РАБОТЕ ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ И БАЗЫ ДАННЫХ 43 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 44
РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ВАРИАНТА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАМЕН ОДИНОЧНЫХ НУКЛЕОТИДОВ В ГЕНАХ TNF (-238 g/A И -308 g/A), IFNG (+874 Т/А), CTLA4 (+49 A/g), PTPN22 (+1858 С/Т), HLA-LMP2 МЕТОДОМ «ПРИМЫКАЮЩИХ ПРОБ» 44
РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ВАРИАНТА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ HLA-DPB1, HLA-DMB МЕТОДОМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК ПО СЭНГЕРУ 50
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ. 53
ПРОВЕРКА СООТНОШЕНИЯ ХАРДИ-ВАЙНБЕРГА В ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ. 54
ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ HLA-DPB1, HLA-DMB, HLA-LMP2 В ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ 55
Распределение аллелей гена HLA-DPB1 55
Распределение аллелей гена HLA-DMB 57
Распределение аллелей гена HLA-LMP2 58
3.6 ИЗУЧЕНИЕ ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ЗАМЕН ОДИНОЧНЫХ
НУКЛЕОТИДОВ В ГЕНАХ TNF (-238 G/A И -308 G/A), IFNG (+874 Т/А), PTPN22
(+185 8С/Т), CTLА4 (+49A/G) В ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ 60
3.6.1 Частота встречаемости замены одиночного нуклеотида
в гене TNF (-238 g/A) 60
3.6.2 Частота встречаемости замены одиночного нуклеотида
в гене TNF (-308 g/A) 62
3.6.3 Частота встречаемости замены одиночного нуклеотида
в гене IFNG (+874 Т/А) 64
3.6.4 Частота встречаемости замены одиночного нуклеотида
в гене PTPN22 (+1858 С/Т) 66
3.6.5 Частота встречаемости замены одиночного нуклеотида
в гене CTLA4 (+49 A/g) 68
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 70
ВЫВОДЫ 73 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 74 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 75
СПИСОК, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ
ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения
СД 1 типа - сахарный диабет 1 типа
ПНР - полимеразная цепная реакция
АПК - антиген-презентирующая клетка
IDDM - Insulin-Dependent Diabetes Mellitus (инсулин-зависимый сахарный диабет)
HLA- Human Leukocyte Antigens (антигены тканевой совместимости человека)
NCBI - National Center for Biotechnology Information (Национальный центр
информации по биотехнологии США)
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
TNF - Tumor Necrosis Factor (фактор некроза опухолей, ФНО)
IFNG - Interferon, gamma (интерферон гамма)
PTPN22 - protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22 (lymphoid)
CTLA4 - Cytotoxic T-Lymphocyte Associated antigen-4 (поверхностный антиген
цитотоксических Т-лимфоцитов)
FAM - 6-карбоксифлуоресцин
HEX - 6-гексахлорфлуоресцин
Введение к работе
Актуальность работы
Сахарный диабет первого типа (СД 1 типа) — заболевание, характеризующееся дефицитом секреции инсулина р-клетками поджелудочной железы. Большинство случаев сахарного диабета 1 типа связаны с аутоиммунными процессами. Существенная роль в развитии СД 1 типа принадлежит генетическим предрасполагающим факторам.
Распространенность СД 1 типа среди населения различных стран колеблется от <0,1 до 2%. В настоящее время в мире насчитывается более 10 млн. больных СД 1 типа.
Значительная доля в исследованиях связанных с патогенезом СД 1 типа принадлежит иммуногенетике и смежным дисциплинам (молекулярная генетика и молекулярная биология). Роль иммуногенетики состоит не только в выявлении механизмов наследования аутоиммунных заболеваний, но и в уточнении представлений о механизмах развития болезни, дополнении информации о предохраняющих и предрасполагающих факторах в развитии заболеваний, а таюке формировании гипотезы о совокупности экзогенных и эндогенных факторов, приводящих к болезни.
Одним из наиболее перспективных направлений в современной иммуногенетике заболеваний является поиск генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие иммунопатологии а таюке полиморфных маркеров в генах-кандидатах и выявление их ассоциации с наследственными заболеваниями.
Установление ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов с СД 1 типа и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют большое значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного больного.
Цель исследования
Исследовать ассоциации замен одиночных нуклеотидов в генах TNF (-238 g/A и -308 g/A), IFNG (+874 Т/А), PTPN22 (+1858 С/Т), CTLA4 (+49 A/g), и аллелей генов HLA-DMB, HLA-LMP2, HLA-DPB1 с развитием СД 1 типа.
Задачи исследования
Разработать реагенты и методики для определения замен одиночных нуклеотидов в генах TNF (-238 g/A и -308 g/A), IFNG (+874 Т/А), PTPN22 (+1858С/Т) и CTLA4 (+49A/g).
Разработать реагенты и методики для генотипирования по локусам HLA-DPB1, HLA-DMB и HLA-LMP2.
С помощью разработанных реагентов и методик исследовать частоту встречаемости замен одиночных нуклеотидов в генах TNF (-238 g/A и -308 g/A), IFNG (+874 Т/А), PTPN22 (+1858С/Т) и CTLA4 (+49A/g) и частоту встречаемости аллелей генов HLA-DMB, HLA-LMP2 и HLA-DPB1 в русской популяции среди больных СД 1 типа и в контрольной группе.
Используя статистические методы выявить ассоциацию замен одиночных нуклеотидов в генах TNF (-238 g/A и -308 g/A), IFNG (+874 Т/А), PTPN22 (+1858С/Т), CTLA4 (+49A/g), а также аллелей генов HLA-DMB, HLA-LMP2, HLA-DPB 1 с развитием СД 1 типа.
Научная новизна работы
Впервые получены данные о частоте встречаемости аллелей генов HLA-DMB, HLA-LMP2 и HLA-DPB 1 у русских жителей г. Москвы среди больных СД 1 типа и в контрольной группе.
Впервые получены данные о частоте встречаемости замены одиночного нуклеотида в гене CTLA4 (+49A/g) в московской популяции среди больных СД 1 типа и среди представителей контрольной группы, не несущих ни одного из «классических» маркерных гаплотипов HLA.
Практическая значимость работы
Установлены ассоциации полиморфизма ряда генов с развитием сахарного диабета 1 типа, что создает создает возможность оценки индивидуального генетического риска и имеет большое значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данного заболевания в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного больного.
Разработаны и внедрены в производство лабораторные варианты тест-систем для определения замен одиночных нуклеотидов в генах TNF (-238 g/A и -308 g/A), IFNG (+874 Т/А), PTPN22 (+1858С/Т), CTLA4 (+49A/g) и аллелей генов HLA-DMB, HLA-LMP2, HLA-DPB1.
Характеристика геномного полиморфизма в исследованных популяциях имеет общее популяционно-генетическое значение и служит віоіадом в развитие фундаментальной науки.
Основные положения, выносимые на защиту
Полученные для исследованных популяций данные показывают, что замена аденина на гуанин в 49 позиции нуклеотидной последовательности первого экзона гена CTLA4 ассоциирована с развитием СД 1 типа.
Полученные для исследованных популяций данные показывают отсутствие ассоциации развития сахарного диабета 1 типа с аллельными состояниями генов HLA-DPB1, -DMB, -LMP2 и замен одиночных нуклеотидов в генах TNF (-238 g/A и -308 g/A), IFNG (+874 Т/А), PTPN22 (1858С/Т).
Примененный в работе метод генотипирования с помощью аллель-специфичной ПЦР «в реальном времени» обладает рядом преимуществ перед другими распространенными подходами и может быть рекомендован для использования в лабораторной практике.
Личный вклад автора
Автором разработаны лабораторные варианты тест-систем, проведены основные эксперименты, обработаны и обобщены полученные результаты. Все основные результаты получены лично автором.
Публикации
Основное содержание диссертации изложено в 4 публикациях, в том числе: 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук, и 2 публикации в материалах отечественных и зарубежных научных конгрессов.
Апробация диссертации
Диссертация апробирована на заседании секции № 2 Ученого совета ГНЦ «Института иммунологии ФМБА России» от 19 июня 2008 г. и рекомендована к защите на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности «14.00.36 - аллергология и иммунология».
Структура и объем работы
Работа изложена на 91 странице, состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы», раздела «Результаты исследований», раздела «Обсуждение полученных результатов» выводов и списка литературы. Работа включает 24 рисунка и 25 таблиц.
