Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Главный комплекс гистосовместимости человека 12
1.1.2. Генетическая карта области HLA человека 13
1.1.3. Строение и функционирование HLA-мопекуп
1.1.3.1. Строение HLA-молекул класса I .15
1.1.3.2. Строение HLA-молекул класса ff 18
1.1.3.3. Функции молекул HLA 21
1.1.4. Клиническое и биологическое значение полиморфизма HLA-генов 23
1.2. "HLA ибояезни" 25
1.2.1. Предполагаемые причины.и механизмы ассоциаций HLA-аллелей с болезнями 26
1.2.2 Ассоциации между HLA-системой и заболеваниями... 28
1.2.2.1.HLA и гемобластозы 30
1.3. Современные методы исследования системы HLA 41
1.3.1. Методы HLA-типирования, основанные на Пир .42.
1.3.1.1. PCR-SSP (Полимеразная цепная реакция с сиквенс-специфическими праймерами) 45
1.3.1.2. PCR-SSOP (Полимеразная цепная реакция + сиквенс-специфические олигонуклеотид ные пробы) 46
1.3.1.3 PCR-SBT (Полимеразная цепная реакция + типирование, базирующееся на сиквенировании) .47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 48
2.1. Исследуемый контингент.. 48
2.2.-2.3. Методы выделения и исследования анализируемого материала 50
2.2. Метод ы выделения исследованного материала 50
2.2.1. Выделение мононуклеарных клеток 50
2.2.2.Экстракция ДНК с помощью протеиназы К 50
2.2.2.1.Выделение ДНК из клеток периферической крови для амплификации локусов DRB1 и DQB1 50
2,2.2.2.Выделение ДНК методом высаливания белков 51
2.2.2.3.Выделение ДИК фенольно-хлороформньш методом... 51
2.2.3.0пределение концентрации и чистоты ДНК 52
2.3. Методы исследования анализируемого материала 52
2.3.1.Серологическое типирование , 52
2.3.2. Амплификация ДНК 53
2.3.2.1. Амплификация локуса HLA-DRB1 (PCR-SSP) 53
2.3.2.2. Амплификация локуса HLA-DRB1 в модификации ГНЦ-институт иммунологии (PCR-mSSP) .55
2.3.2.3. Амплификация локуса HLA-DQB1 (PCR-mSSP)
2.3.2.4. Амплификация аллелей специфичности HLA-A19 (PCR-SSP) 56
2.3.3. Гель-электрофорез продуктов амплификации 57
2.4.Статистическая обработка результатов 58
ГЛАВА 3. Контроль качества типирования и получение контрольных стандартов 60
3.1. Контроль качества типирования методом PCR-SSP 60
3.2. Распределение вариантов генов HLA класса I и II в популяции восточнославянских кавказоидов 65
3.3. Особенности строения пептидсвязывающего сайта молекулы DR... 71
ГЛАВА 4. Иммуногенетические маркёры гемобластозов 78
4.1 Иммуногенетические показатели больных острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) 78
4.2. Иммуногенетические показатели больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). 84
4.3. Иммуногенетические показатели больных хроническиммиелопейкозом(ХЛЛ) .89
4.4. Ассоциации HLA-системы с предрасположенностью и резистентностью к развитию лимфогранулематозом (ЛГМ) 93
ГЛАВА 5. Ассоциации между строением антигенсвязывающего сайта молекулы dr и гемобластозами .104
Глава 6. Распределение и наследование hla-антигенов/ специфичностей в семьях больных гемобластозами .127
Заключение 138
Выводы 157
Практические рекомендации 159
Литература
- Строение HLA-молекул класса ff
- Метод ы выделения исследованного материала
- Распределение вариантов генов HLA класса I и II в популяции восточнославянских кавказоидов
- Иммуногенетические показатели больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ).
Строение HLA-молекул класса ff
Методами рентгеновой кристаллографии [Bjorkman е.а., 1987; Brown е.а.,1988; Bjorkman, Parham,1990] показано, что длина молекулы HLA-A -70 А, масса - 43 кДа. а цепь состоит из трех доменов, два из которых (сс1 и а2) образуют дистальную часть молекулы, проксимальная часть формируется третьим доменом тяжелой цепи аЗ и (32 микроглобулином. Дистальная часть молекулы формирует антигенсвязывающий участок. Конформация антигенсвязывающего участка представляет собой 4 антипараллельные 3-складчатые структуры, переходящие в а-спирали. Оба домена а1 и а2 расположены так, что по четыре (3-складки каждого вместе образуют платформу из 8 полос, а а-спирали того и другого домена находятся на некотором расстоянии друг от друга. В результате образуется углубление или так называемая "бороздка", ограниченная с обеих сторон а-спиралями, которые имеют форму арок, т.е. удаляются друг от друга в центре и сближаются у ее концов с обеих сторон. Размер бороздки 2,5 нм. Она служит для размещения антигена, образовавшегося в результате процессинга анти-генпредставляющими клетками, размерами около 9 ак остатков, с которыми связываются HLA молекулы класса I.
На примере В27 установлена структура процессированного антигена [Madden, 1991; Коненков, 1999]. Это наномер развернутой структуры с легким изгибом между ак остатками 3 и 4. Боковые цепи выдаются в стороны от основной цепи таким образом, что некоторые из них обращены внутрь и в ак позициях 2, 3, 7 и 9 могут взаимодействовать только с молекулой HLA, другие в позиции 5 и 6 могут взаимодействовать как с молекулой HLA, так и Т-клеточным рецептором, а находящиеся в положении 4 и 8 - только с Т-клеточным рецептором. Различные аллели молекул МНС обоих классов легче связываются с пептидами, имеющими только определенные последовательности аминокислот, что указывает на содержание в некоторых позициях пептида так называемых «якорных» остатков, определяющих сродство к молекулам HLA разных аллельных вариантов.Ак, встречающиеся в данной позиции более чем у 20% пептидов, считаются якорными [Hammer е.а.1993; Sidney е.а., 1995; Maffei, Harris, 1998; Коненков, 1999]. Молекулы МНС класса I разных аллельных вариантов связывают пептиды различного ак строения с определенными остатками ак в «якорных» позициях: это С-концевой остаток и 2-й или 5-й с N-конца. Иммунный ответ может развиться только на те пептиды (антигены), которые способны связаться с МНС индивида. При отсутствии связывания пептида с одним из вариантов МНС индивида иммунный ответ не развивается и организм беззащитен перед данным антигеном.Так, все олигопептиды, связывающиеся с молекулой В27, имеют аргинин в положении 2. С молекулой HLA-A0201 взаимодействуют только фрагменты белков, содержащие лейцин или метионин в позиции 2 и валин или лейцин в позиции 9. Кристаллографическое изображение комплексов HLA+олигопептид [Роит и соавт., 2000] говорит, что боковые цепи якорных остатков пептида принимают участие в образованиеЪпреде- / ленной конформационной структуры, пространственно соответствующей бороздке в HLA-молекуле класса I каждого аллеля.
HLA-C ген отличается от от А и В низкой экспрессией на молекулярной поверхности, связанной с негативной регуляцией элементов трансляции (за исключением специфичности С7) [Tatari е.а., 1996].Однако с помощью сшвенирования ДНК гена HLA-C показан значительный полиморфизм ло-куса С, при этом 28% всех аллелей типируются как Cw12-18, т.е. серологически не определяемые, а гомозиготность не превышает 10% (50% при серологическом определении) [Turner е.а., 1998].
Гены локусов DR, DQ и DP кодируют аир цепи молекул, из которых р цепи более полиморфны. В молекулах HLA класса I! полиморфны все р-цепи, из а-цепей наиболее полиморфна цепь DQct, DPa менее полиморфна и DRa - инвариантна [Орр,1994]. Молекулы класса II - мембранные гли-копротеины. Тяжелая a-цепь и легкая р-цепь нековалентно связаны. Каждая из цепей образует по два экстрацеллюлярных домена а1 и а2 и р1 и р2 длиной 90 ак. Аминокислотные замены сгруппированы в первых двух доменах [Bodmer е.а., 1998].
Кристаллографический анализ трехмерной структуры молекулы DR1 показал, что в формировании антигенсвязывающего участка принимают участие дистальные а1 и р1-домены, кодируемые вторыми экзонами соответствующих генов [Brown е.а., 1993]. Антигенсвязывающий сайт представлен в виде В-складчатого основания, на котором находятся две а-спирали, расположенные в противоположных направлениях, что формирует щель (бороздку), аккумулирующую один соответствующий пептидный лиганд (рис. 2). Пептиды, связываемые МНС класса II обычно длиной 13-16 ак остатков (от 10 до 20) [Rudensky е.а., 1991; Brown е.а., 1993; Rotzscke, Falk,1994]. Сайт состоит как из консервативных аминокислотных ак остатков, связывающих главную цепь презентируемого пептида, так и из полиморфных "карманов", аккумулирующих боковые цепи пептида. При связывании пептидов молекулами МНС класса II дополнительные «якоря» служат регуляторным компонентом в селекции пептидов [Latek е.а. 2000]. В связь с конкретным пептидом вовлекаются как консервативные ак (например, консервативный триптофан-W В61 HLA DR располагается так, что его индольный азот образует водородную связь с карбонильной группой главной цепи связываемого пептида в точной гомологии к локализации и функции триптофана 147 молекул HLA классаІІ), так и аллельно-варьирующие [Madden е.а., 1992; Brown е.а., 1993]. Первый кластер полиморфных остатков молекулы DR (а31,52, 686,89,90) обеспечивает вариабельность участка антигенсвязывающей бороздки, состоящего из наиболее консервативных неполярных ак остатков (а26,32,43,54+В81). Кластеры полиморфных остатков образуют механизм, посредством которого различные аллели HLA селективно связывают пептиды с различными последовательностями [Brown е.а., 1993; Hammer е.а., 1993; Appella е.а.1995; Madden, 1995; Garcia е.а, 1998]. Так, пептид вируса герпеса связывается с гаплотипом DQA1 0501/DGB1 0201, но не с DQA1 0202/DQB 1 0201, различие между которыми составляет в DQA цепи 15 ак остатков [Хаитов, Алексеев, 1998]. Полиморфные аминокислотные остатки DRB-цепи образуют несколько гипервариабельных регионов (ГВР). Первый ГВР (9-14 ак остатки) и 2й ГВР (26-33 ак остатки) расположены на дне бороздки и влияют на связывание пептидов, Зй ГВР - в регионе спирали. Зй ГВР влияет как на связывание пептида, так и на взаимодействие с Т-клеточным рецептором (TCR) [Doherty е.а., 1998]. Предсказать какие пептидные мотивы будут связываться сданным вариантом молекулы МНС класса II сложнее.чем у молекул класса І, поскольку у молекул класса II пептидсвязывающая щель открыта с обеих сторон, что потенциально позволяет пептиду связываться с молекулой HLA различными способами [Southwood е.а., 1998].
Пептиды, связывающиеся с DQ отличаются от рестриктируемых DR молекулами [Texier е.а., 2001]. В молекуле DQ варьирующий остаток аспар-татовой кислоты р57 образует соляной мостик с консервативным аргинином а76.
Метод ы выделения исследованного материала
Экстракция ДНК с помощью протеиназы К (модификации метода Blin и Stafford, 1976) 2.2.2.1. Выделение ДНК из клеток периферической крови для амплификации локусов DRB1 и DQB1 с помощью праймеров «ДНК-технология» (PCR-mSSP) ДНК выделяли из ядерных клеток периферической крови, взятой с антикоагулянтом (ЕДТА, цитрат Na), путем троекратной обработки лизирую-щим буфером (0,32 М сахарозы, ЮмМ трис HCI, рН 7,5, 5 мМ MgCI2, 1% тритон Х-100) и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 20-30 сек. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 60 мкл буфера, содержащего 50 мМ Kcl, 10 мМ Трис-НСІ, рН 8,3, 2,5 мМ MgCI2, 0,45% NP-40, 0,45% Tween-20, а также 250 мкг/мл протеиназы К при 55 в течение 30-45 мин. Протеиназу К инактивировали при 100 С в течение 5 мин.
Осадки клеточных ядер, полученные как описано вцщ отмывали один раз Н20 (13000 об/мин, 1 мин) и ресуспендировали в 2 мл пробирке в 80 мкл 5х буфера (0,375 М NaCI, 0,12 М EDTA, рН 8,0), добавляли 30 мкл протеиназы К (10 мг/мл), 20 мкл 20% SDS, 240 мкл Н20. Инкубировали при 55 С 20-30 мин. Добавляли 100 мкл 6М NaCI, образцы энергично встряхивали 15 сек, центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин. Супернатант переносили в чистую пробирку, центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин. Переносили супернатант в чистую пробирку добавляли 2-3 объема 96 этанола. Преципитировавшую ДНК осаждали центрифугированием. Отмывали 70 этиловым спиртом. Удаляли этиловый спирт. Преципитаты ДНК растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации 50-100 мг/мл.
Выделение ДНК фенольно-хлороформным методом осажде ния белков для амплификации HLA-A19, DRB1 (PCR-SSP) [Bohme е.а., 1983 с модификациями] Лимфоцитарную взвесь (см. 2.2.1.) в объеме 2-4x1 Об/мл или осадки клеточных ядер (см. 2.2.2.1.) ресуспендировали в 2 мл пробирке в 300 мкл STE буфера (10 мМ Трис-НСІ, рН 8,0, 100 мМ NaCI, ЮмМ ЕДТА, рН 8,0), добавляли 15 мкл протеиназы К (10 мг/мл), 7 мкл 20% SDS. Инкубировали при 37 С в течение ночи или при 55 С в течение 2 часов. Добавляли 8 М ацетата аммония, равный объем перегнанного фенола (рН 8,0), центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 мин. Верхнюю фазу собирали в чистую пробирку, не затрагивая интерфазу. Вносили равный объем хлороформа, центрифугировали (14000 об/мин, 5 мин), переносили в чистую пробирку, вносили ацетат Na до конечной концентрации 300 мМ. Добавляли 2-3 объема 96 этанола. Для лучшей преципитации ДНК инкубировали при -70С в течение 30 мин. Преципитаты осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 14000 об/мин. Отмывали 70 этиловым спиртом. Спирт удаляли. ДНК растворяли в дистиллированной воде до концентрации 50-100 мг/мл.
Определение концентрации и чистоты ДНК Концентрацию и чистоту полученной ДНК определяли спектрофотомет-рически. Одна OD (оптическая единица) соответствовала концентрации ДНК 50 мг/мл. Чистота ДНК определялась соотношением показателей при 260 нм и 280 нм (OD260/OD280). Использовалась ДНК с показателями OD260/OD280 между 1,65 и 1,8.
Серологическое типирование HLA-A, -В, -Cw типирование осуществляли в двухступенчатом микро-лимфоцитотоксическом тесте по методу NIH (1979) с некоторыми модификациями. 1 мкл лимфоцитарной взвеси в концентрации 2-4x1 О /мл вносили в лунки микропланшета, с предварительно внесенными под вазелиновое масло 1 мкл типирующих сывороток. Инкубировали 30 мин при 37 С. Вносили 5 t мкл кроличьего комплимента. Инкубировали 60 минут при 22 С. Вносили 5 V мкл эозина К, фиксировали 5 мкл 20% формалина. Оценку степени лизиса производили на световом микроскопе по 4-балльной системе. Использовали сыворотки Санкт-Петербургского НИИГиПК (АО » Тиссанс"), Минского НИИГиПК и "One lambda" (USA). В локусе А определяли 21 антиген, в локусе В- 43 антигена, в локусе С - 8.
Полимеразную цепную реакцию проводили в пробирках объемом 500 мкл. Каждая пробирка содержала 10 мкл реакционной смеси: 100 нг геномной ДНК, полученной любым из выше перечисленных способов, в 2 мкл; 200 мМ каждого dNTP s; 16 мМ (NH4)2S04; 67 мМ Трис-НСІ, рН 8,8; 1,5 мМ Мд СІ2; 0,1% Tween 20; 0,5 ед. термостабильной ДНК-полимеразы Biotaq и по 5 мкл смесей праймеров (использовали праймеры "Dynal", Norway, или "Bio-Synthesis", Inc., USA) к соответствующим специфичностям (при-мер расположение праймеров см. на рис. 6.) или аллелям локуса DRB1, а также праймеры внутренного контроля (к гену соматотропина). Амплификацию проводили на термоциклере "МС2" (АО"ДНК-технология", Москва). Температурный режим амплификации: 94С-2 мин; 10 циклов:94С-10 сек, 65С-60 сек; 20 циклов: 94С-10 сек, 61С-50 сек, 72 С-30 сек. Детекцию продуктов амплификации проводили гель-электрофорезом (см. 2.3.3.). Визуализация результатов проводилась при помощи трансиллюминатора. Документировали результаты (фотографировали) при помощи видеосистемы «Gel Imager». Продукты амплификации были видны в виде полос красно-оранжевого цвета.
Распределение вариантов генов HLA класса I и II в популяции восточнославянских кавказоидов
Было изучено аминокислотное строение аллельных вариантов антиген-связывающего сайта молекулы DR в здоровой популяции. Для анализа использованы данные нуклеотидных (и аминокислотных) последовательностей генов молекул МНС человека, представленные на сайте Всемирного комитетеа по номенклатуре HLA http://www.anthonvnolan.orQ.uk/HlG/html.
Строение антигенсвязывающего сайта молекулы HLA класса II (рис. 2) показывает, что в её формировании принимают участие, как аминокислотные (АК) остатки в консервативных позициях (т.е. одинаковые у молекул различных специфичностей), так и АК остатки в полиморфных позициях. Полиморфные позиции пептидсвязывающей бороздки у молекулы DR принадлежат Д-цепи, кодируемой вторым экзоном гена DRB1 (ос-цепь, кодируемая геном DRA, инвариантна). Имеются несколько кластеров полиморфных АК остатков, формирующих гипервариабельные регионы (ГВР) АГ-связывающего сайта. Первый и второй ГВР расположены на дне бороздки, они преимущественно влияют на связывание пептидов и тем самым играют существенную роль в презентации пептидов Т-клеткам; тре 72 тий ГВР расположен в районе спирали и влияет как на связывание пептида, так и на взаимодействие с TCR (ТКР - Т-клеточным рецептором) [Do-herty е.а., 1998; Southwood е.а., 1998]. Замены АК остатков в полиморфных позициях, формирующих складчатое дно пептидсвязывающей бороздки, доступны для распознавания антителами (или в СКЛ - смешанной культуре лимфоцитов), их ассоциации с заболеваниями можно выявить, определив наличие ассоциаций с болезнями у специфичностей, определяемых этими заменами. Однако имеются полиморфные позиции, АК в которых могут встречаться как у одного или нескольких аллелей определенной серологической специфичности, так и у нескольких аллелей других специфичностей. Серологически или в клеточных реакциях их выявить нельзя, однако они доступны при молекулярном типировании, так как кодируются 2м экзоном гена DRB1. Изменения в нуклеотидной последовательности гена DRB1 определяются при типировании с "высоким разрешением", а нуклеотидная последовательность легко может быть переведена в аминокислотную. Так, в р 37 аминокислотной позиции антигенсвязывающей бороздки могут быть расположены Ser (все аллели DRB1 01, аллели DRB1 0304, 0406, 0419-21, все аллели DRB1 15 и 16), Asn (DRB1 0301-03, 0305, 09, 1109, 1301/02, 1305/06, 1402/03), а также Туг, Phe и Leu. По большей части такие позиции расположены на боковых стенках антигенсвязывающей полости (спиралях), например АК остатки в позициях J5 67-74 - Зий гипервариабельный регион - ГВР, которые существенно варьируют внутри одной серологической специфичности, но могут быть одинаковы для многих серологически различных вариантов [Doherty е.а., 1998]).
Распределение встретившихся нам замен АК остатков в полиморфных позициях, кодируемых вторым экзоном гена DRB1, в контрольной группе представлено в табл. 11 для 1-го ГВР, в табл. 12 -для 2-го ГВР, в табл. 13 - для 3-го ГВР и замен в краевых позициях Э 57, 58, 77, 86. Результаты получены при ДНК-типировании гена DRB1 с высоким разрешением, что дало возможность с помощью базы данных Всемирного Комитета по но 73 менклатуре HLA установить для выявленных аллелей нуклеотидную последовательность второго экзона DRB1, её разбивку на кодоны и, следовательно, кодируемые ими аминокислоты, которые участвуют в образовании пептидсвязывающего сайта молекулы DR.
Наиболее часто в нашей контрольной группе в 1м ГВР в позиции В9 встречался Glu, в позиции р10 примерно с одинаковой частотой Gin и Туг, в (311 - Ser, в В12 - Lys, в Д13 - Ser, в В1- Glu. Во 2м ГВР в В26 позиции чаще всего встречался Туг, в В28 - Asp, в ВЗО - Туг, в В31 - Phe, в В32 -Туг. В позиции В37 наиболее распространенными АК остатками являлись Asn и Туг. В позиции В57 наиболее часто встречался Asp, в 658 - Ala. Среди замен АК остатков в полиморфных позициях Зго ГВР в В67 наиболее часто встречались Leu и Не, в В70 - Asp, в В71 - Arg, в В73 - Ala, в В74 - Ala. В 77 позиции Thr встречается чаще, чем Asn, а в позиции 86 частота Gly ненамного превышает частоту Val.
В доступной нам литературе соответствующие данные по другим популяциям отсутствуют.
Анализ распределения АК замен в полиморфных позициях пептидсвязывающего сайта молекулы DR у здоровой популяции подтвердил, что: 1). АК последовательности в основании антигенсвязывающего сайта значительно варьируют среди различных серологических вариантов и гомогенны внутри серологической специфичности, 2). большинство АК замен в основании пептидсвязывающей бороздки не являются эксклюзивными только для одной серологической специфичности. 3). В полиморфных позициях, расположенных в краевых участках пептидсвязывающей бороздки, особенно в 3-м ГВР, напротив, АК замены часто варьируют внутри серологической специфичности, хотя бывают одинаковы для многих серологически различных вариантов. Например, среди встретившихся нам вариантов DRB1 13 нашей контрольной группы в позиции В57 у DRB1 1301 и 1302 находился остаток аспартата, а у DRB1 1303 - серина (также как у аллеля 0801). Можно полагать, что свя 74 зывание пептидов и, следовательно, презентация пептидов Т-клеткам будут в основном однотипны внутри одной специфичности, однако взаимодействие с TCR внутри специфичности может варьировать из-за различий между аллельными вариантами.
Таким образом, нами выявлено распределение аминокислотных последовательностей, формирующих варианты (на уровне специфичностей и аллелей) пептидсвязывающей бороздки молекулы DR в здоровой популяции восточно-славянских кавказоидов.
Иммуногенетические показатели больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ).
Хотя наибольший риск развития ХМЛ был присущ носителям DQB1 0503 и DQB1 0601 (RR=12,07), АЗЗ (RR=6), однако из-за низкой частоты этих аллелей для них отмечены низкие показатели этиологической фракции (0,083). Наиболее значительная этиологическая фракция отмечена для антигенов DRB1 11 (0,258), DQB1 (0,258) и Cw7 (0,236).
По показателям критерия относительного риска с резистентностью к развитию ХМЛ ассоциировались HLA антигены А2, В50, В53; наименьший относительный риск развития ХМЛ для нашей популяции был отмечен для специфичности локуса DRB1 - DRB1 04 (рис.17). Рис. 17. RRflnfl HLA-генов, ассоциированных с резистентностью к развитию ХМЛ
DR4 также, как и DR1 и DR9 содержит ак последовательности, связывающиеся с наиболее распространенной формой химерного протеина Ь3а2 [Mannering е.а., 1998; Yasukawa е.а., 1998; Yasukawa е.а.,2000], который, следовательно, может быть представлен Т-клеткам в контексте этих вариантов молекулы HLA. Хотя снижение частоты встречаемости DRB1 01 и DRB1 09 в нашей выборке больных ХМЛ было выражено статистически не достоверно в отличие от снижения частоты DR4; относительный риск развития ХМЛ при носительстве этих вариантов был понижен: RR для DRB1 01 - 0,445, для DRB1 09 - всего 0,354. Наибольшая превентивная в отношении ХМЛ фракция отмечена для Cw4 (0,241) и DRB1 04 (0,23).
Исследованы HLA-показатели у 68 больных лимфогранулематозом. Средний возраст больных составил 34,4 года. Отмечалось повышение заболеваемости ЛГМ в возрастной группе 16-30 лет, однако в нашей выборке не был выражен второй возрастной "горб" заболеваемости ЛГМ - у людей старше 50 лет (рис.11). Мужчины составляли 48,5% (33 человека). Среди больных преобладали пациенты с «классическими» вариантами ЛГМ: нодулярный склероз - 58,8 % (40 человек), смешанно-клеточный вариант - 36,8% больных (25 человек), лимфоидное истощение - 2,9% (2 человека). Вариант лимфоидное преобладание наблюдался у 1,5% (1 пациент).
Распределение частоты антигенов HLA-A, В и С при ЛГМ представлено в табл. 20. Не отмечено статистически значимого увеличения частоты каких-либо антигенов в локусе А. Выявлено повышение частоты носитель-ства антигенов в локусе В - В17 и С - Cw7 и Cw8 (р 0,05).
У больных ЛГМ отмечалось снижение частоты антигенов А23 (р 0,01), А29 (р 0,05), В27 (р 0,05), В37 (р 0,05), В53 (р 0,5), а также достоверное снижение Cw1-4 .
Среди специфичностей HLA класса II (табл. 21) у больных ЛГМ выявлено увеличение встречаемости HLA-DRB1 11 (р 0,001), снижение встречаемости DRB1 01 (р 0,05), DRB1 07 (р 0,01). В нашей выборке у больных ЛГМ отсутствовала специфичность DRB1 09. Среди аллелей локуса DQB1 имелось достоверное увеличение встречаемости вариантов 0503, 0601 и 0301 и снижение 0502/04 (р 0,05).
Среди гаплотипов отмечено значительное повышение частоты гаплоти-па Cw7-DRB1 11 (35,9% vs. 1,3% в контроле, р 0,001) и DRB1 11-DQB1 0301 (49,6% vs. 6,96% в контроле, р 0,001).
Анализ ассоциативных связей антигенов и специфичностей HLA с ЛГМ показал, что наибольшими индивидуальными факторами риска для развития ЛГМ, ассоциированными с HLA-системой являлись Cw7, Cw8 и DRB1 11 (повышение относительного риска развития ЛГМ соответственно более чем в 3,3, 10 и 6 раз по сравнению с лицами, не имеющими данных антигенов/специфичностей (см. рис. 18).
С учетом фенотипической частоты в популяции наиболее сильную ассоциацию с ЛГМ проявляли Cw7 (EF=0,419), DRB1 11 (EF=0,469) и DQB1 0301 (EF=0,385). Таблица 20 Распределение антигенов HLA класса І у больных ЛГМ (п=67) HLA n частота достоверность RR EF PF у больных у здоровых различий
Однако у больных с гистологическим вариантом СКВ этот антиген отсутствовал (различия между группами достоверны, р 0,05). Напротив, В60 был достоверно (по сравнению с контролем) повышен у больных с вариантом СКВ (RR=3,47), однако оставалсяУїределах контрольных величин у больных НС (рис. 20).
У больных обоими гистологическими вариантами отмечалось статистически значимое повышение частоты DRB1 11 (при этом RR=4,39 при НС и RR=3,56 при СКВ), однако присутствие этой специфичности у больных выявлялось более чем в 1,5 чаще при НС, чем при СКВ (р 0,05). Не выявлено достоверных различий в частоте антигена Cw7, статистически значимо повышенного при обоих вариантах ЛГМ, хотя он в большей степени ассоциируется с риском развития НС, чем СКВ (RR= 8,52 при НС и RR=2,84 при СКВ), Частота антигена В27 была достоверно снижена у больных СКВ (RR=0,187), но не отличалась от контрольной у больных НС. Следовательно, DRB1 11, как и Cw7, являются факторами риска развития обоих вариантов ЛГМ, однако между гистологическими вариантами ЛГМ «нодулярный склероз» и «смешанно-клеточный вариант» имеются определенные иммуногенетические различия, ассоциированные с HLA-B локу-сом. Антиген В49 является фактором повышения риска развития ЛГМ в гистологическом варианте «нодулярный склероз», В60 - фактором повышения риска развития «смешанно-клеточного варианта». Для «смешанно-клеточного варианта» ЛГМ имеется также индивидуальный протективный фактор В27.
