Введение к работе
Лптуальпссть пссяедогзаэй HLA-система исследуется на всех уровнях организации живой материи - от молекулярного до надорганизмен-ных, в частности, популяционного. В течение послед!!с^ десятилетия исследования HLA-белков на молекулярном и надмолекулярных уровнях позволили достичь кардинально новой степени в понимании принципов распознавании своего и чужого, организации молекулярных комплексов и трансдукции акти-вационного сигнала, уточнить области МНС-рестрикции иммунного ответа (Strominger J.C., Wiley D.C. et. al., 1987-1994, Ljunggren H.-G. et. a!.. 1990, Rammensee H.-G. et. al., 1990, 1993, Kabelitz D., 1992, Germain R.N., 1994, Vives J., 1994). Однако, реализация этих качественных принципов, то есть механизмы функционирования HLA-молекул на разных уровнях организации иммунной системы в норме и, тем более, при патологии, практически не изучены, хотя иерархии структур должна строго соответствовать иерархия механизмов регуляции (Лозовой В.П., 1988, Курганов Б.И. и соавт., 1989).
Основным специфическим объектом исследований в клинической иммунологии являются периферические лимфоциты и моноциты (мононуклеарные клетки, МК), чей состав по субпопуляционной принадлежности и уровню дифференцировки определяется системными факторами, а свойства отдельных клеток и взаимодействующих клеточных групп - факторами саморегуляции клеточного уровня. Здесь в поведении HLA-молекул как интегральных мембранных белков (Kourilsky F.M. et. al., 1972), должны учитываться постоянно осуществляемые процессы синтеза, экспрессии, секреции и реабсорбции (Любимов А.В., 1981). Все эти процессы также должны быть определенным образом организованы во времени, т.е. оформлены в биологический ритм определенной частоты, так как принцип временной компартментации метаболитов также универсален, как и принцип пространственной компартментации (Фридрих П., 1986), а околочасовая периодичность характерна для клеточного и тканевого уровней (Бродский В.Я., Нечаева Р.В., 1988). В то же время неясно - является ли такая периодичность фактором авторегуляцин этих уровней, или же это регуляторный сигнал вышестоящих систем, иными словами, это проблема физической природы и локализации осциллятора высокочастотных биологических ритмов.
Изучение аутоиммунных заболеваний, прежде всего ревматоидного артрита (РА), показало нарушения во всех известных иммунных феноменах и механизмах (Ширинский B.C., Лозовой В.П., 1985, Чередеез А.Н., Ковальчук Л.В., 1989, Strober S., Holoshitz J, 1990, Ratcliffe L.T. et al., 1994). Однако, данные о присутствии в циркуляции при этой патологии значительной доли активированных клеток, зачастую не учитываются при сопоставле-
ний функциональных свойств МК больных и доноров, хотя основные состояниям клетки - пролиферативный покои и активация - характеризуются совершенно разными цитофизиологическими параметрами (Епифанова О.Е. и соавт., 1988, 1989, Робинсон М.В., 1994, Trufakin V.A. et а!.. 1994).
В то же время, при РА отчетливо выражены наследственные факторы, проявляющиеся ассоциированностью носительства определенных HLA-генов и наличием заболевания, его клиническими вариантами, эффективностью лекарственной терапии, отдельными параметрами иммунной системы (Лозовой В.П. и соавт., 1988, Серова Л.Д., 1989, Коненков В.И., 1989, Deigh-ton СМ. et. al., 1993, Olive С. et. al., 1994). Несмотря на то, что механизмы реализации HLA-ассоциированности шире функционирования только самих HLA-продуктов на клеточном уровне, очевидно, что накопление таких данных будет полезным для понимания патогенетических механизмов и разработки прогностических критериев.
Особый интерес представляет сравнительное изучение в норме и при РА функций HLA-молекул в МНС-нерестриктированных взаимодействиях, в частности, в функционировании естественных киллерных лимфоцитов.
Отдельным механизмам функционирования иммуноцнтов как клеток соответствуют частично перекрывающиеся концепциям топогенеза поверхностных белков (Blobel С, 1980, Лузиков В.Н., 1990) и рециклинга (Быковская С.Н., Грунтенко Е.В., 1982, Mcintosh D. et. al., 1990, Jondal M. et al., 1994). С целью объединения отдельных аспектов изучения молекулярно-кле-точных механизмов функционирования HLA-белков было предложено понятие биогенеза структурных компонентов клеточных мембран, включающее в себя процессы трансляции и транскрипции нуклеиновых кислот, экспрессии генов на уровне мРНК; экспрессии, латеральной диффузии, секреции и реаб-сорбции поверхностных гликопротеинов (Коненков В.И. и соавт., 1988).
Очевидно, что изучение механизмов функционирования HLA-молекул на клеточном и тканевом уровнях должно быть плодотворным в рамках этой концепции, позволяющей объединить иммунологическую феноменологию с закономерностями биологии клетки, включая и временные параметры.
Цепь- исследования:
исследование функциональной значимости постсинтетических этапов биогенеза HLA-продуктов и вспомогательных молекул циркулирующих клеток иммунной системы у здоровых лиц и больных ревматоидным артритом.
Задачи:
1. исследовать взаимосвязь иммуноцитологических, функциональных и временных параметров экспрессии и секреции HLA-белков в норме;
-
изучить уровни экспрессии HLA-продуктов I и II классов на субпопуляциях циркулирующих ИКК, оценить патогенетическую значимость и диагностические возможности этих параметров при РА;
-
оценить сывороточный уровень и секрецию in vitro продуктов HLA-комплекса I и II классов в норме и у больных РА;
-
выявить функциональное значение уровня экспрессии HLA-продуктов и костимуляторных белков в функционировании естественных киллерных лимфоцитов;
-
исследовать возможности модуляции уровня экспрессии HLA-продуктов покоящихся клеток;
-
проанализировать ассоциированность показателей биогенеза HLA- и костимуляторных белков с носительством аллельных вариантов генов HLA-комплекса I класса.
7. оценить диагностическую значимость определения субпопуляций
HLA-DR-экспрессирующих циркулирующих клеток при неаутоиммунной па
тологии.
Оспозаые положения, выносимые на защиту
1. В покоящихся мононуклеарных клетках периферической крови здоро
вого человека процессы циркуляции мембранного материала организованы в
околочасовые клеточные ритмы, что проявляется в циклических и взаимо
связанных изменениях мембранной топографии/экспрессии HLA- и других
поверхностных белков, их секреции в окружающую среду и реабсорбции.
Последняя для HLA-DR-белков может осуществляться через специфический
рецептор массой «40кДа. Отдельные фазы этого цикла определяют способ
ность МК вступать в контактные межклеточные взаимодействия с аутологич-
ными и чужеродными клетками, что проявляется в периодически череду
ющихся фазах максимально возможного ответа и относительной рефрактер-
ности.
Процессы рециклизации мембранного материала покоящихся МК позитивно и негативно регулируются гуморальными факторами иммунной системы.
Размах эндогенных колебаний клеточных параметров ограничен генетическими факторами, маркируемыми носительством определенных сочетаний HLA-генов.
2. В иммунной системе ОКР являются фактором авторегуляции как
минимум, до тканевого уровня. Осциллятором высокочастотной периодики
являются концентрационные колебания, обусловленные природой водных рас
творов в среде космопланетарных факторов, в частности, определенного уров-
ня ионизирующего излучения. В водных растворах, контактирующих с кис-лород-содержащей атмосферой, природные липидные, модельные липидные и другие полупроницаемые компартменты не препятствуют прохождению водно-ионных потоков. В этом смысле на клеточном уровне липидный бислой является минимальной морфологической структурой, ответственной за ОКР.
3. При ревматоидном артрите изменения значений параметров биогене
за HLA-белков, в особенности, HLA-DR, а также IgM, HLFA-1, Fcy-RIII
(CD16), проявляются в разнонаправленных изменениях уровня их экспрес
сии, скорости латеральной диффузии, динамики секреции; в их неуправляе
мости факторами позитивной регуляции рециклинга покоящихся клеток. Схо
жесть этих и других функциональных показателей клеток больных РА с та
ковыми у стимулированных МК здоровых лиц, дает основание сделать вы
вод об активированном состоянии основных субпопуляций циркулирующих
МК при данном заболевании.
Одним из наиболее выраженных расстройств иммунорегуляции при РА на тканевом уровне является измененное соотношение основных циркулирующих субпопуляций активированных Т-лимфоцитов. Значения повышенного содержания HLA-DR-экспрессирующих Т-лимфоцитов (в основном, за счет С04-позитивных) в комплексе со значениями уровня экспрессии HLA-DR обладают при РА свойствами качественного показателя.
-
Распознавание чужеродных антигенных структур естественными кил-лерными лимфоцитами является HLA-нерестриктированным, но HLA-зави-симым, так как HLA-белки обоих классов наряду с HLFA-1 и Fcy-RIII являются структурами, непосредственно ответственными за распознавание и индукцию литической активности ЕК-лимфоцитов. У здоровых лиц выделяется два характерных типа обеспечения одинакового уровня функциональной активности ЕК: 1) обусловленный HLFA-1-, Fey-, HLA-ABC- и HLA-DR-белками, экспрессированными на HLFA-1 Fcy-RIII -лимфоцитах; 2) обусловленный HLFA-1- и HLA-DR-белками, экспрессированными на HLFA-1 rcy-RIII -лимфоцитах. У больных РА функциональная активность ЕК значительно снижена; при этом примерно у трети больных частично сохраняется второй тип - литическая активность обусловлена HLFA-1- и HLA-DR-белками, но экспрессированными «a HLFA-1 Fcy-RIII -лимфоцитах. Снижение литической активности ЕК у больных РА обусловлено активацией части HLFA-1 Fcy-RIII -лимфоцитов, что проявляется гиперэкспрессией на них HLA-DR; эти клетки не участвуют в литическом акте и су-прессируют такую активность других ЕК.
-
Представитель макроглобулинов, АБПА, является фактором авторегуляции ИКК. Модифицированная форма АБПА обладает свойствами уси-
ливать пролиферацию преактивированных лимфоцитов, но отменять в своем присутствии поликлональную митогениндуцированную и олигоклональную ал-лоантигениндупированную пролиферацию лимфоцитов. В последнем случае эффект реализуется как на уровне антиген-распознающих лимфоцитов, так и на уровне антиген-представляющих CD3 DR -лимфоцитов и DR -моноцитов, у которых АБПА вызывает заметное снижение DR-экспрессии, не связанное с эффектом экранирования. Среди поверхностных белков циркулирующих МК показана мембранная форма АБПА массой «85кДа и два аффинанта АБПА с массами около 80 и 75кДа. У женщин вне гестационного периода и мужчин основными продуцентами АБПА (и других макроглобулинов) являются потомки периферических МК. Научная новизна
Показано, что изменения поверхностной топографии белков лимфоцитов в процессе латеральной диффузии сопровождаются появлением их новых количеств, а сам процесс ЛД в лимфоцитах периферической крови, существует эндогенно; эти и другие проявления циркуляции мембранного материала и их функциональные последствия во времени организованы в околочасовые клеточные ритмы. Выявлен осциллятор высокочастотных клеточных ритмов.
Продемонстрировано значительное увеличение уровня экспрессии HLA-DR на активированных периферических Т-лимфоцитах при РА, изменения уровня экспрессии HLA-белков I и II классов и костимуляторных белков на всех субпопуляциях периферических МК при данной патологии.
Кинетика секреции растворимых форм HLA-белков периферическими нестимулированными МК больных РА характерна для стимулированных МК здоровых лиц.
Выявлен мембранный белок МК, обладающий свойствами рецептора для растворимых форм HLA-DR-белков.
Обнаружено снижение литической активности ЕК при РА, сопровождающееся увеличением содержания клеток с фенотипическими характеристиками ЕКК, для выявления которых предложено одновременное определение HLFA-1 и Fcy-RIII. Проведен анализ зависимости функциональной активности ЕК и их иммуноцитологических характеристик, ставший возможным благодаря учету уровня экспрессии продуктов гистосовместимости обоих классов на субпопуляциях ЕК-лимфоцитов.
Изучен источник и индукторы локального синтеза макроглобулинов вне гестационного периода; продемонстрирована модуляция АБПА уровня экспрессии HLA-DR, уточнено его влияние на индукцию пролиферации покоя-
щихся клеток. Выявлены как мембранная форма АБПА, так и его аффинан-ты, экспрессируемые периферическими МК.
Определены генетически детерминированные границы варьирования иммунопатологических и функциональных параметров ИКК, маркируемые носи-тельством определенных HLA-генов I класса в норме и при РА.
Практические рекомендации
Так как постоянное присутствие в кровотоке активированных клеток отражает патогенез РА, определение параметров экспрессии HLA-DR на Т-лимфоцитах при этом заболевании имеет высокую диагностическую значимость (приоритет метода на уровне изобретения), а для дифференциальной диагностики РА является полезным определение как литической активности ЕК, так и клеток с фенотипом ЕК. Однако, определение на периферии активированных клеток, в том числе и основных субклассов регуляторных Т-лимфоцитов, не является универсальным методом иммунодиагностики при всех заболеваниях. Кроме этого, необходимо учитывать, что свойства активированных периферических МК при РА некорректно непосредственно сопоставлять со свойствами преимущественно покоящихся периферических клеток в норме. В частности, этот факт имеет прямое отношение к проблеме оценки иммунного статуса и лекарственных препаратов in vitro. Очевидно, что это может быть актуальным в изучении и других аутоиммунных заболеваний.
Понятие "эндогенные иммуномодуляторы" в полной мере применимо к макроглобулинам. Широкий спектр активностей, проявляемых этими белками, их способность комплексироваться с цитокинами, нейромедиаторами, делают их чрезвычайно перспективными как фармакологические препараты. Наряду с этим, очевидно, необходимы технологические исследования по более точной адресации иммуноактивных препаратов: по времени воздействия, по локализации и состоянию клеток-мишеней.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Профилактика, диагностика и лечение аутоиммунных заболеваний и вторичны} иммунодефицитов" (Новосибирск, 1985); Всесоюзной конференции Методология, организация и итоги массовых имунологических исследований" (Москва-Ангарск, 1987), IV Всесоюзной конференции по патологии клеткі (Москва, 1987); I Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи, 1989), IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев-Москва, 1989); IV Международно? конференции по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека (Вена 1989); IV международной конференции по иммунофармакологии (Рим 1989); 1 съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); Международное
7 симпозігуме по иммунологии репродукции (Киев, 1993); Ежегодной отчетной конференции Института клинической иммунологии (Новосибирск, 1993); 12 Международном конгрессе по фармакологии (Торонто, 1994), 12 Европейском совещании иммунологов (Барселона, 1994); Международной конференции "Нейроиммунология, нейроинфекции, нейроимидж" (С-Петербург, 1995).
Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании семинара Института клинической иммунологии СО РАМН и общества иммунологов 8 июня 1995 г. (г. Новосибирск).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 44 печатные работы, получено одно авторское свидетельство.
Объем в структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, материалов и методов исследования, 8 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя. Она изложена на 300 страницах машинописи и иллюстрирована 40 таблицами и 58 рисунками. Библиографический указатель включает 637 источников.
