Введение к работе
Актуальность проблемы.
Инфекционные заболевания и осложнения продолжают занимать значительный удельный вес в- общей структуре заболеваемости населения, несмотря на достижения современной медицины. В последние годы возросла частота заболеваний стафилококковой этиологии, которые отличаются тяжестью течения, малой результативностью или неэффективностью антимикробной терапии. Широкое распространение получили внутригос-питальные стафилококковые инфекции (Зайцева Г.А., 1990; Cunney R.J. et al.,1996) .Весьма грозным заболеванием является столбняк, летальность при котором составляет более 40%. Особенно она высока среди больных детей и стариков (Traverso Н.Р. et al., 1991; Heath Т.С. et al., 1996). Клещевой.знце? фалит представляет одну из сложных проблем здравоохранения. Это связа-но с тяжестью и длительностью заболевания, поражением центральной нервной системы больного, высокой летальностью, частотой необратимой инвалидности (Верета Л.А. и соавт., 1994; Tomazic I. et al., 1997).
В комплексном лечении бактериальных, вирусных заболеваний, гнойно-септических осложнений все большее значение приобретают иммунные препараты крови. В последние годы их роль особенно возросла в связи с повышением устойчивости патогенной микрофлоры к большинству применяемых антибиотиков (Jenkis S.G.,1996). Ряд авторов считает, что причина увеличения частоты гнойно-септических процессов и некоторых инфекционных заболеваний кроется не только в появлении антибиотико-устойчивых форм микробов, но и в изменении иммунного статуса населения (Константинов В.Н., 1988, Барсуков B.C., 1989: Fleischer В. et al., 1991). В настоящее время с целью заместительной терапии широко используются иммунная плазма и иммуноглобулины (ИГ) различной направленности для внутримышечного введения. Несмотря на высокую терапевтическую эффективность указанных лечебных средств, они обладают рядом существенных недостатков и мало эффективны при тяжелых гнойно-септических и
вирусных заболеваниях (Сапожникова B.C., 1990; Анастасиев В.В., 1997).
Перспективным направлением повышения эффективности заместительной иммунотерапии является разработка и изготовление препаратов с высокой специфической активностью, пригодных для внутривенного введения. Этот путь применения препарата, в отличие от внутримышечного, позволяет вводить ИГ в больших, необходимых для лечения дозах и быстро увеличивать уровень специфических антител в крови реципиента. Высокая терапевтическая эффективность иммуноглобулинов для внутривенного введения (ИГВВ) подтверждена многими исследованиями у нас в стране и за рубежом (Мигунов В.Н. и соавт.,1995; Sun К.О. et al., 1994; Sanders R.K.11996).
Первые препараты ИГ, пригодные для внутривенного введения, были получены в начале 60-х годов. Они были приготовлены путем протеоли-тического расщепления пепсином или плазмином как полимеров, так и значительной части мономеров IgG (Barandun S. et al., 1962). В настоящее время в разных странах для получения ИГВВ предложено несколько методов, но основным требованием при изготовлении является снижение антикомплементарной активности при сохранении титров антител. В нашей стране пока существует единственный производственный метод получения иммуноглобулина для внутривенного введения, разработанный И.А.Киселевой и В.В.Анастасиевым (1976,1981). Метод основан на кислотно-ферментативной обработке ИГ, очищенного и концентрированного спиртовым фракционированием. Он вписывается в комплексную технологию фракционирования плазмы и доступен большинству учреждений, занятых производством препаратов. В настоящее время по разработанной технологии "Иммуноглобулин нормальный человека для внутривенного введения" (ФС 42-3159-95) выпускается на ряде предприятий страны. Его получают из пула сыворотки или плазмы крови доноров, содержащего усредненные уровни различных антител, характерные для данной популяции.
Для повышения терапевтической эффективности ИГ необходимо шире внедрять в практику препараты для внутривенного введения нї. \
ленного действия, в которых концентрация антител к определенным антигенам в 5 и более раз выше, чем в нормальном ИГ (ВОЗ, 1982). Однако отечественных специфических ИГВВ до настоящего времени нет. Проблема разработки и получения специфических ИГВВ является комплексной и включает в себя несколько аспектов. Это заготовка иммунного сырья в необходимых объемах, определение требований к нему; разработка технологии изготовления препаратов, изучение их физико-химических и иммунобиологических свойств, а также определение терапевтической эффективности ИГВВ.
Всё возрастающие потребности в иммунном сырье обусловливают необходимость поиска дополнительных источников его получения. Научные исследования Российского НИИ гематологии и трансфузиологии показывают, что приоритетным в этом направлении следует считать серологический скрининг донорской крови и плазмы по выявлению "естественных" сывороточных антибактериальных антител с целью последующего получения иммунного сырья (Мельникова В.Н. и соавт., 1989; Смирнова А.И.,1990). Вместе с тем, проводимая в широких масштабах намеренная иммунизация доноров для получения иммунной плазмы далеко не всегда дает ожидаемый результат и требует более целенаправленного отбора лиц с активной выработкой антител (Демидова Н.В., 1982; Зайцева Г.А.,1990).
Одним из важных этапов создания специфических ИГВВ является разработка технологии их получения. Отечественная технология изготовления внутривенного ИГ существует около 20 лет. Современный мировой опыт производства ИГ свидетельствует о необходимости улучшения каче-ггвенных характеристик готового препарата, то есть усовершенствования імеющейся в нашей стране технологии получения внутривенного ИГ.
Таким образом, создание препаратов внутривенных иммуноглобу-іинов для терапии бактериальных и вирусных инфекций является актуаль-юй задачей медицинской науки и практики.
Цель исследования. Разработка и изучение лечебной эффектности новых препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введе-
ния: антистафилококкового, противостолбнячного и против клещевого энцефалита.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
Оценить возможность получения гипериммунной плазмы серологическим скринингом донорской крови и плазмы на наличие "естественных" специфических антител.
-
Разработать критерии определения потенциальной иммунологической реактивности доноров при их намеренной иммунизации.
-
Установить требования к исходному сырью (содержание специфических антител, условия и сроки хранения иммунной плазмы).
-
Усовершенствовать существующую технологию производства внутривенного иммуноглобулина.
-
Получить новые препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения; антистафилококковый, противостолбнячный, против клещевого энцефалита.
6. Изучить терапевтическую эффективность разработанных специ
фических иммуноглобулинов для внутривенного введения в клинике и экс
перименте.
Научная новизна. Впервые применен комплексный научно-обоснованный подход к проблеме создания ИГ направленного действия для внутривенного введения, включающий этапы заготовки иммунного сырья, разработки технологии их получения и изучения лечебной эффективности препаратов.
На основании результатов изучения частоты встречаемости среди доноров лиц с высокими титрами "естественных" антибактериальных и противовирусных антител показана возможность получения от них иммунной плазмы.
Определение потенциальной иммунологической реактивности донора при намеренной иммунизации позволяет производить отбор "перспективных" антителопродуцентов при комплектовании групп иммунных доноров. С иммуногенетических позиций показана нецелесообразность
привлечения к искусственной иммунизации носителей определенных антигенов.
Получены новые данные об уровнях специфических антител в исходном сырье и препаратах ИГ, позволяющие дифференцировать подходы к созданию специфических ИГВВ.
Проведенные исследования по освобождению иммуноглобулиновых растворов от остаточного спирта с помощью ультрафильтрации позволили предложить новую схему изготовления ИГВВ. При этом препарат получается более высокого качества и технологическая схема сокращается на три стадии.
Разработан новый вариант кислотно-ферментативного метода получения ИГВВ, улучшающий его качественные характеристики. На "Способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения" получен патент-Российской Федерации № 2068695 от 10 ноября 1996 г.
Впервые разработаны специфические ИГВВ: антистафилококковый, противостолбнячный, против клещевого энцефалита. При этом противостолбнячный ИГВВ разработан в сухой форме с длительным (до 3-х лет) сроком хранения.
На способы получения ИГВВ антистафилококкового и против клещевого энцефалита получены приоритетные справки № 96104591 от 20.03.96 г. и № 96109309 от 22.05.96 г. соответственно.
Установлены и сформулированы требования к препаратам, показана их терапевтическая эффективность в клинике и эксперименте.
Практическая значимость.
Обоснована возможность заготовки иммунной плазмы путем выявления доноров с "естественно" высоким содержанием антибактериальных и противовирусных антител. Система серологического скрининга донорской крови и плазмы по выявлению специфических сывороточных антител с целью последующего получения иммунной плазмы внедрена в практическую деятельность станции переливания крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови.
Рекомендован метод отбора доноров для намеренной иммунизации с учетом потенциальной иммунологической реактивности индивида. Отстранение от иммунизации лиц, ареактивных к определенному антигену, предотвращает неоправданную антигенную нагрузку на их организм, сокращает нецелесообразные материальные затраты. Применение разработанного способа-прогнозирования иммунного ответа на станции перелива-: ния крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови, Свердловской областной станции переливания крови (г.Первоуральск), в государственном медицинском производственном объединении "Сангвис" (г.Екатеринбург) позволило увеличить число иммуноактивных лиц при намеренной иммунизации до 80-85%.
Результаты работы легли в основу нормативно-технической документации на производство иммуноглобулина человека антистафилококкового для внутривенного введения, который разработан совместно с Нижегородским государственным предприятием по производству бактерийных препаратов. На препарат утверждена временная фармакопейная статья (ВФС) 42-2854-97 оті 1.03.97 г., изменения к регламенту производства № 2 и № 8 от 15 марта 1993 года, инструкция по применению (утверждена Минздравом Российской Федерации 15.03.1993 года).
Применение препарата в медицинской практике показало его высокую эффективность в комплексном лечении тяжелообожженных, больных неспецифическими заболеваниями легких, с гнойно-септическими осложнениями и другими заболеваниями стафилококковой этиологии.
Препарат выпускается серийно станцией переливания крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови, Нижегородским государственным предприятием по производству бактерийных препаратов, его выпуск осваивается также Нижегородским областным центром крови.
Совместно с Хабаровским НИИ эпидемиологии и микробиологии, Хабаровским предприятием по производству иммунобиологических препаратов разработан и прошел 'клинические испытания "Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита для внутривенного введенім".
нические испытания показали высокую лечебную эффективность препарата при менингеальной и очаговых формах клещевого энцефалита.
Для утверждения в ГИСК им. Л.А.Тарасевича представлена необходимая нормативно-техническая документация на препарат (письмо ГИСКа им. Л.А.Тарасевича от 09.07.97 г. № 01-46/5):
отчет о результатах оценки лечебной. эффективности применения иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита для внутривенного введения (одобрен Ученым советом ГИСКа 7.10.97 г., протокол № 17),
ВФС на препарат, , , .
регламент производства препарата,
инструкция по его применению.
Разработаны требования, технология получения, проведены экспе-, . риментальные исследования противостолбнячного иммуноглобулина, для , внутривенного введения, которые свидетельствуют о его высоком терапев- . , тическом эффекте. Получение препарата в сухой форме с длительным,сро-.,. ком хранения (до 3-х лет) позволит иметь его запас на случай стихийных, бедствий и катастроф.
Результаты работы вошли в методические рекомендации "Лечение инфекционных осложнений при проведении современных программ терапии острых лейкозов" ( Киров, 1997 г.), которые утверждены Минздравом Российской Федерации 15.01.1997 г. № 97/5.
Материалы исследования используются в преподавании на кафедре гематологии и трансфузиологии ФУВа Пермской государственной медицинской академии на базе Кировского НИИ гематологии и переливания крови.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА-ЗАЩИТУ
1. Скрининг донорской крови и плазмы на наличие "естественных^' , ,-специфических антител и отбор "перспективных" доноров - антителрпро-дуцентов при намеренной иммунизации позволяют увеличить объемы заго-гочки иммунного сырья и избежать неоправданной антигенной нагрузки на организм донора.
2. Для изготовления ИГВВ: антистафилококкового с содержанием
антиальфастафилолизина не менее 20,0 МЕ/мл, противостолбнячного - не
менее 30,0 МЕ/мл столбнячного антитоксина, против клещевого энцефали
та с титром антител к вирусу клещевого энцефалита не менее 1:40 должна
использоваться иммунная плазма, хранившаяся при температуре 6,0 + 4,0С
не более одного Месяца и в замороженном состоянии при температуре не
выше минус 20С не более трех месяцев, с титрами антител для антистафи
лококковой плазмы - 4,5 + 0,5 МЕ/мл антиальфастафилолизина, противо
столбнячной - 7,5 + 0,5 МЕ/мл столбнячного антитоксина, противоэнцефа-
литной -1:10 и выше к вирусу клещевого энцефалита.
-
Усовершенствованная технология производства внутривенного иммуноглобулина, включающая ультрафильтрацию и новый вариант метода кислотно-ферментативного гидролиза, позволяет получать ИГВВ направленного действия (антистафилококковый, противостолбнячный, против клещевого энцефалита) высокоспецифичные, качественные и стабильные в процессе хранения.
-
Клинические испытания ИГВВ антистафилококкового и против клещевого энцефалита, изучение в эксперименте противостолбнячного ИГВВ свидетельствуют о высокой лечебной эффективности разработанных препаратов.
Основные результаты и положения работы доложены на II Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (г.Челябинск, 1986 г.); Ill Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (г.Киров,1991 г.); 3-й международной конференции по службе крови стран Восточной Европы (г.С-Петербург,1996 г.): III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (г.С-Петербург,1996 г.); республиканских и зональных научно-практических конференциях, а также неоднократно докладывались на итоговых научных конференциях Кировского НИИ гематологии и переливания крови.
По материалам диссертации опубликованы 44 научные ;лч<>:.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертация изложена на 282 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, трех глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 476 источников, из них 204 отечественных и 272 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 63 таблицами.
![Оптимизация получения лейкофильтрованных эритроцитных гемокомпонентов и их применения в трансфузионной терапии операционной кровопотери [Электронный ресурс]](/i/i/4498/200249.png "Оптимизация получения лейкофильтрованных эритроцитных гемокомпонентов и их применения в трансфузионной терапии операционной кровопотери [Электронный ресурс] Пугина Наталья Вячеславовна")