Введение к работе
Актуальность проблемы, Иммуноферментный анализ (ИФА) все шире применяется для определения микроколичеств самых различных соединений в диагностических и научно-исследовательских целях. Разработаны разнообразные варианты ИФА, каждый из которых имеет свои преимущества и особенности, используемые при решении конкретных диагностических или исследовательских задач.
Особое место среди вариантов ИФА занимает метод немеченных антител, основанный на использовании комплекса, состоящего из фермента и антител к нему. Одним из часто используемых вариантов метода немеченных антител является ПАП-метод, в котором взамен антител, химически сшитых с пероксидазой хрена (ПХ), используют ПАП-комплекс, состоящий из ПХ и антител к ПХ. Если первые антитела имеют ту же видовую принадлежность, что и антитела, входящие в состав ПАП-комплекса, то они могут быть легко связаны мостиком из антител, направленных против иммуноглобулинов того вида животных, к которому относятся первые антитела.
Наряду с ИФА широкое распространение находят моноклональные антитела (МКА), направленные против самых различных антигенов. Одна из областей, где получение достоверной диагностически значимой информации возможно только с помощью МКА, - это иммунофенотипирование клеток по наличию поверхностных антигенных маркеров [Барышников А.Ю. и др., 1989]. Использование в этих целях ИФА позволяет в сравнении с иммунофлуорес-ценцией получать более обширную информацию, поскольку дает возможность исследовать одновременно иммунофенотип и морфологию клеток. Преимущества ПАП-метода в сравнении с другими методами иммунофер-ментного анализа ярче всего проявились в иммуногистохимических исследованиях, поскольку для ПАП-метода характерны низкие фоновые реакции. В связи с этим использование ПАП-метода в иммуногистохимии получило
довольно широкое распространение. [Рустамова Р.З. и др., 1983, Erber W.N. et. al. 1983, Feller А.С. et. al. 1983, Morich F.-J. et. al. 1983, Poletti A. et. al. 1987]. ПАП-метод может быть успешно использован также и для выявления с помощью МКА различных растворимых антигенов, имеющих диагностическую значимость.
Цель работы. Целью диссертационной работы явилось конструирование моноклонального ПАП-набора (пероксидаза-антипероксидаза), предназначенного для проявления взаимодействия МКА с различными антигенами, и оценка возможностей его применения.
Задачи исследования:
-
На основе МКА против пероксидазы хрена сконструировать набор для проведения иммуноферментных реакций методом ПАП.
-
Изучить стабильность компонентов ПАП-набора и входящих в его состав МКА против ПХ в сравнении с другими МКА.
3. Показать возможности применения ПАП-набора для выявления
с помощью МКА различных растворимых и клеточных антигенов, а также
мышиных поликлональных антител.
4. С помощью ПАП-метода провести характеристику специфичности
МКА против различных цепей иммуноглобулинов человека.
Положения, выносимые на зашиту:
-
Разработан моноклональный ПАП-набор, предназначенный для проведения иммуноферментных реакций с использованием МКА.
-
Максимальная интенсивность ПАП-реакции регистрируется в ограниченном интервале концентраций ПХ в составе ПАП-комплекса, зависит от RZ ПХ и концентрации связующих антител.
-
Стафилококковый реагент, содержащий белок А, применим для очистки мышиных иммуноглобулинов и МКА.
-
С помощью ПАП-метода охарактеризована группа моноклонапьных антител, выявляющих различные цепи иммуноглобулинов.
Научная новизна. Показано, что моноклональный ПАП-набор применим
для определения с помощью МКА антигенов поверхности клеток на криостатных срезах и в суспензии клеток, для выявления растворимых антигенов, для иммуноблоттинга и определения специфических поликлональных антител. Разработаны экспресс-варианты применения ПАП-набора для выявления различных антигенов с помощью МКА. С помощью ПАП-набора определено, что МКА ИКО-30 направлены против ц-цепей иммуноглобулинов человека, МКА ИКО-97 взаимодействуют с Р(аЬ')г-участком иммуноглобулинов G человека, а МКА ИКО-106 и ИКО-107 выявляют соответственно Х- и х-цепи иммуноглобулинов человека. Впервые в стандартизованных условиях изучена устойчивость МКА различных изотипов к обработке протеолитическими ферментами. Продемонстрирована связь стабильности МКА с их изотипом. Выявлено, что наиболее устойчивыми являются МКА 2а-изотипа класса G.
Практическая значимость.
На основе МКА против ПХ разработан диагностический моноклональный ПАП-набор для иммунопероксидазного проявления реакции МКА с антигенами поверхности клеток и растворимыми антигенами. Отработаны методы применения ПАП-набора, которые позволяют усовершенствовать методический уровень проведения иммунодиагностических реакций с помощью МКА при выявлении растворимых и клеточных антигенов. Охарактеризованные в работе МКА против различных цепей иммуноглобулинов применимы для иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга при миеломатозе и лимфолейкозах, а также для определения количественного содержания иммуноглобулинов в биологических жидкостях.
Апробация работы. Полученные результаты доложены на Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагности-кумов" (Москва, 1988г.), на I Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989 г.), на Юбилейной конференции, посвященной 100-летию Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. ГН.Габричевского,
на VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997г.).
Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторной научной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии с участием членов Ученого Совета ННИИЭМ 23 апреля 1997 г..
Объем и структура диссертации. Работа в объеме 139 листов машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов, обсуждения, выводов и указателя литературы. Диссертация иллюстрирована 36 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 123 источника литературы (74 отечественных и 49 иностранных авторов).
![Оптимизация получения лейкофильтрованных эритроцитных гемокомпонентов и их применения в трансфузионной терапии операционной кровопотери [Электронный ресурс]](/i/i/4498/200249.png "Оптимизация получения лейкофильтрованных эритроцитных гемокомпонентов и их применения в трансфузионной терапии операционной кровопотери [Электронный ресурс] Пугина Наталья Вячеславовна")
