Введение к работе
Актуальность темы.Развитие медицинской биотехнологии, включающее фундаментальные теоретические исследования и масштабные практические разработки, создало основу крупного промышленного производства разнообразных биологически активных соединений, в частности, гомологичных и гетерологичных препаратов иммуномоду -ляторов белковой природы из различных видов биологического сырья. В эксперименте и клинической практике из тимусов различных наземных млекопитающих успешно применяются препараты тимозин (Gold-etein А., 1976 ), тимопоэтин ( Goldstein G.,1975 ), тактивин (Арион В.Я.,1975), тимарин (ІЛорозов В.Г. и др.,1978), тимоптин (Скобельцына Е.С.и др.,1989), которые помогают корректировать нарушения иммунной системы.Установлено, что аминокислотная последовательность одинакова для действующей субстанции oCj- тимозина, полученного из ткани тимуса человека, крупного рогатого скота, свиньи, овцы. В то же время замечена видовая специфичность гуморальных тимических факторов наземных млекопитающих и при этом установлена более низкая иммуностимулирующая активность этих вв -щвств по сравнению с известным тимозином из тимуса телят.
Широкое изучение биологически активных веществ гидробионтов позволило разработать технологии получения препаратов полипептидной природы из тимуса морских млекопитающих, в прошлом - нереализуемого продукта зверобойного промысла (Ермолин Г.А. и др.,1982; Коротаев Г.К. и др.,1986).Клинические испытания показали перспективность использования новых препаратов из тимуса гренландского тюленя наряду или взамен аналогичных коммерческих препаратов из тимуса телят.
Предполагают, что молекулы иммуноглобулинов и тимусных гормонов являются предшественниками иммунорегуляторных пептидов (Чипенс Г.И. и.др.,1987), а наличие v -последовательностей иммуноглобу линов на Т-супрессорных клетках тимуса доказано экспериментально ( Preneco м.,1981 ),Очевидно, что выявление гомологичных иммуно-глобулиновых детерминант позволит расширить критерии оценки иммуностимулирующей активности препаратов из тимуса млекопитающих, а также объяснить природу анафілактогенннх свойств, характерных для гетерологичных препаратов при внутривенном введении. Однако иммунная система тюленя мало изучена ( Cavagnolo Н., Yedro'e N. ,1979 ), и ее исследование представляет самостоятельный интерес.
Ослабление иммунной системы под влиянием антропогенных факторов создает необходимость оценки уровня иммуноглобулинов тюленя
в целях контроля сырья и конечных продуктов медицинской биотехнологии, а также для успешного конструирования диагностических тест-систем и проведения вакцинации животных ( Osterheus A.D. et ві. , 1989; GrechevM., 1989)-
Методы серологической систематики убедительно доказали монофи -летическую природу таксона ластоногих и выявили высшее 100 содержание - подгруппы вариабельности тяжелой цепи среди многих позвоночных ( Сарга Y.D. et al. ,1973), ЧТО П03В0ЛЯЄТ HCnOflbSOBaTblgG
тюленя в системах серологического типирования подгрупп Н-цепи млекопитающих, в частности, проводить анализ нормальных иммуноглобулинов, миеломных белков, иммунных и других антител, а также мембранных иммуноглобулинов лимфоцитов.
Очевидно, что указанные исследования требуют анализа иммунохи-мической природы изотипов иммуноглобулинов тюленя и, следовательно, диагностических реагентов для их определения - моноспецифических антисывороток. Сведений о коммерческом выпуске или экспериментальном производстве подобных антисывороток нет, хотя в литературе подчеркнута актуальность использования антител к сывороточным белкам ластоногих для решения прикладных и научных задач.
Цель и задачи научных исследований.Целью настоящего исследования явилась разработка методов получения новых препаратов - кроличьих моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам Gi А> u тюленя pagophilus groenlsndica для иммунохимического анализа в биотехнологии (контроль качества препаратов-иммуномодуляторов), ветеринарии (конструирование диагностических тест-систем), в научных исследованиях (иммунотаксономия, изучение структуры и функции иммуноглобулинов человека и животных).
В задачи исследования входило: I.Разработать методы получения иммунохимически чистых igG, IgA, igU из сыворотки тюленя, подобрать оптимальную схему фракционирования сыворотки.
2.Разработать методы получения моноспецифических антисывороток, не требующих адсорбции, используя принцип иммунизации иммунными комплексам
3.Апробировать полученные антисыворотки для качественной и количественной характеристики иммуноглобулинов тюленя. 4.Провести выявление и анализ антигенного родства сывороточных бед ков тюленя, человека и ряда лабораторных животных.
5.Изучить возможность использования полученных моноспецифических антисывороток для оценки иммунохимической чистоты иммуноактивных препаратов полипептидной природы из тимуса тюленя.
Научная новизна и практическая значимость. І.В результате экспериментальных исследований впервые разработана технология лабораторного получения кроличьих моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам О, A, U тюленя:
-впервые разработана схема фракционирования сыворотки тюленя для выделения и очистки иммуноглобулинов О, A, И, позволяющая выделить указанные иммуноглобулины из одной серии исходного сырья с помощью физико-химических методов, гельфильтрации, ионообменной хроматографии;
-впервые получены моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам в, A, U путем иммунизации очищенхими Ig(J, IgA, XgM;
-впервые разработаны методы получения не требующих адсорбции моноспецифических антисывороток к 1*А и IgM путем иммунизации нерастворимыми иммунными комплексами;
-впервые получена кроличья антисыворотка к СЗ компоненту комплемента тюленя с помощью комплекса зимозан + СЗ тюленя, для приготовления которого использовано известное для наземных млекопитающих сродство СЗ компонента комплемента к полисахариду клеточной стенки дрожжей зимозану. 2.Для иммуноглобулинов морского животного - тюленя - обнаружены новые биологические свойства:
-показан характерный для наземных млекопитающих аффинитет к протамину,Ь -фенилаланину, протеину А клеточной стенки стафилококка;
-установлена гетерогенность структуры IgQ тюленя и гомология обоих его субклассов dgGI и IgG2 человека по J -легким цепям; это объясняет возможность иммунной системы тюленя формировать антитела против llloroooooaoeae, Enterobaoterlaaea*, МуооЪ&с teriaoeaa, Picomavirldae, ParaayxoTirldae;
-обнаружена перекрестная реактивность Igo тюленя cigo человека, мыши, хомяка, собаки.ІвАтюленяс ІвАсобаки,' кошки, IgM тюленя с IgM человека, крупного рогатого скота, собаки, кошки, СЗ тюленя с СЗ собаки; это свидетельствует о тесной филогенетической связи инвариантных и гомологичных участков Н и L -цепей молекул иммуноглобулинов млекопитающих морского и наземного происхождения, слабо изменившихся в ходе эволюции; демонстрирующие перекрестную реактивность преципитаты дают
возможность получить моноспецифические антисьгаоротки к иммуноглобулинам указанных млекопитающих в эффективном способе иммунизации без выделения чистого антигена;
-выявлены неизвестные ранее серологически родственные тюленю белковые антигены различных видов млекопитающих (человека и ряда лабораторных животных) в ^, Ы. ду зонах электрофорети-ческой подвижности: 3.Установлена серологическая активность препаратов иммуномодуляторов из тимуса тюленя за счет присутствия в них сывороточных белков, в том числе иммуноглобулинов, тюленя.
Препараты 1-5 фракций (получены по методу Goldstein A.L, 197?) образуют преципитаты с поливалентной антисывороткой к сывороточным белкам тюленя и с моноспецифическими антисыворотками к иммуноглобулинам тюленя в электрбфоретических зонах подвижности альбумина, макро-, Ь - и Y -глобулинов. Для препаратов 7 фракции преципитатов не обнаружено.Зто объясняет природу анафилактогенных примесей и позволяет дифференцировать препараты иммуномодуляторов полипептид-иой природы по степени очистки. Практическая значимость. I.Составлена "Инструкция по изготовлению и контролю сывороток диагностических против IsG,IeA,I$l тюленя преципитирующих сухих". Утверждена на секции Ученого совята "Мед. биотехнология" МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, протокол М от 21 янв. 1992г. 2.Разработана "Лабораторная методика определения белков сыворотки тюленя, в том числе иммуноглобулинов G>A,k тюленя, в иммуноак-тивных препаратах полипептидной природы", которая войдет в "Технологический регламент производства препарата Тимозин из отходов промысла гренландского тюленя" в качестве раздела "Контроль имму-нохимической чистоты готового препарата".Разрабатываемый регламент основан на методах, указанных в ВФС 42-1837-88 и ВВС 42-1838-88. 3.Моноспецифические антисыворотки к igG.IgA.Ig* тюленя и поливалентная антисыворотки к сывороточным белкам тюленя нашли применение в научных исследованиях Научно-исследовательской лаборатории биологически активных веществ гидробионгов:как реагенты контроля при выявлении гетерологичных белковых примесей в медицинских препаратах--иммуномодуляторах разной степени очистки из тимуса тюленя, для оценки перекрестных реакций сывороточных белков млекопитающих разных видов при разработке иммуноферментных методов определения
А^ -иммунопептидов из тимуса гренландского тюленя и с целью поиска новых источников биологически активных веществ медицинского назначения, а также для идентификация природы субстанции, проявляю-
щей сродство к опиатным рецепторам ( Гос. per. № 01880004050 и » 01880004049 ).
Кроме того с помощью указанных моноспецифичэсхих антисывороток был определен уровень сывороточных иммуноглобулинов гренландского тюленя разного возраста для дополнительной характеристики белков крови морских млекопитающих северного региона (совместно с Лабораторией морфологии и экологии высших позвоночных Института эволюционной морфологии и экологии животных им. А.Н. Северцова). Положения, выносимые на защиту: I.Этапы выделения и очистки igG, igA, 1#« тюленя с помощью осаждения полиэтиленгликолем, гельфильтрации на Ультрагеле АсА-22 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-тоэпале. 2. Изучение биологических свойств иммуноглобулинов тюленя в отношении биоспецифических лигандов: протамина, жакалина, L-фенилаланнна, протеина А клеточной стенки стафилококка. 3.Способы получения антител к и СЗ компоненту комплемента иммунизацией нерастворимыми иммунными комплексами. 4.Использование моноспецифических антисывороток к IgG,lgA,l#i тюленя для определения уровня сывороточных иммуноглобулинов тюленя и идентификации IgG,lgM человека, а также IgG,IgA,1^1 и СЗ компонента комплемента ряда лабораторных животных. 5.Использование моноспецифических антисывороток h IgG.IgA.IgU тюленя для оценки чистоты препаратов полипептидной природы из тимуса тюленя.
Апробация работы. Диссертация апробирована 10 сентября 1992г. на заседании секции Ученого совета "Иммунология и медицинская биотехнология" МНИШ.М км. Г.Н. Габричевского.
Материалы диссертации представлялись на: Конференции молодых ученых НИИ БАВГ 22.03.89., заседаниях Ученого совета НИЛ БАВГ 29.06.89. и 13.06.91., на Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидробионтов* во Владивостоке, ТКНРО, 1991.
Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
Объем и структура диссертации .Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 217 источников (50 отечественных и 167 иностранных авторов).Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста, включает 15 таблиц и 42 рисунка.
![Оптимизация получения лейкофильтрованных эритроцитных гемокомпонентов и их применения в трансфузионной терапии операционной кровопотери [Электронный ресурс]](/i/i/4498/200249.png "Оптимизация получения лейкофильтрованных эритроцитных гемокомпонентов и их применения в трансфузионной терапии операционной кровопотери [Электронный ресурс] Пугина Наталья Вячеславовна")
