Введение к работе
Актуальность проблемы. Широкое распространение заболеваний, связанных с нарушением процессов свертывания крови, ставят перед клиницистами проблему выбора наиболее эффективных способов их ранней диагностики и лечения. Решение этой проблемы невозможно без изучения механизмов свертывания крови, факторов, регулирующих этот процесс, их взаимодействия с другими физиологическими системами организма.
В настоящее время показано, что гйперкоагуляция является одним из основных звеньев патогенеза и сопровождает целый ряд патологических состояний. Среди факторов, регулирующих процесс свертывания ;срови, важное место отводится антитромбину-ІІІ (АТ-Ш), блокирующему преимущественно активацию контактной фазы свертывающего каскада и тромбин.
Согласно литературным данным при таких заболеваниях, как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, сахарный диабет, геморрагический диатез, врожденные пороки сердца, болезни почек и многие другие, уровень и активность АТ-Ш снижены. Причем показано, что такие изменения коррелируют с тяжестью, длительностью заболевания и степенью компенсации состояния больного, а, следовательно, могут служить показателями мониторинга и прогноза течения заболевания.
Помимо диагностической и прогностической значимости оценки количества АТ-Ш в крови больных мониторинг за уровнем АТ-Ш необходим для своевременной компенсации ингибитора, а также для подбора дозы антикоагулянтов при лечении коагулопатий.
Для оценки уровня АТ-Ш применимы следующие лабораторные тесты:
радиальная иммунодиффузия по Манчини, иммуноферментный анализ и
латекс-агглютинация, требующие наличия соответствующей
моноспецифической антисыворотки. Современная отечественная лабораторная практика не располагает целым рядом иммунохимических реагентов, в том числе моноспецифической антисывороткой, а также стандартом для иммунохимического измерения количества АТ-Ш, поэтому получение отечественных иммунохимических реагентов для этой цели весьма актуально. Для автоматизации и повышения скорости выполнения массовых обследований необходима разработка фотометрических методов измерения уровня АТ-Ш - нефелометрического и турбидиметрического анализа. Развитие фотометрических методов в нашей стране сдерживается отсутствием оборудования и реагентов. В связи с этим создание коммерческих отечественных наборов реагентов для фотометрии также является актуальной задачей.
Другим, более важным аспектом проблемы является отсутствие в отечественном лекарственном арсенале и самого препарата (концентрата) АТ-Ш, необходимого как в качестве антикоагулянта, так и кофактора гепарина.
Отсюда становится понятной необходимость разработки отечественных способов выделения очищенного АТ-Ш для получения нового отечественного препарата. Выделение АТ-Ш из крови невозможно без иммунохимического контроля качества получаемых препаратов, предполагающих использование моноспецифических антисывороток и соответствующих стандартов, что предполагает необходимость разработки также и соответствующей иммунохимической тест-системы.
Цель и задачи исследования. Основной целью исследования явилась разработка способа получения очищенного биологически активного АТ-Ш и на его основе - иммунохимических реагентов определения содержания данного антикоагулянта для оценки системы гемостаза в клинической практике.
Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи:
-
разработка оптимальных способов выделения и очистки функционально активного АТ-Ш из сыворотки доноров, а также из балластного осадка IV-I, получаемого в процессе производства препаратов крови спиртовым методом Кона;
-
создание набора иммунохимических реагентов (стандарта АТ-Ш, антисыворотки, гамма-фракции антисыворотки и пр.) для качественного и количественного анализа АТ-Ш;
-
апробация способов иммунохимического контроля АТ-Ш с полученными реагентами в сыворотке доноров: радиальной иммунодиффузии, иммуноферментного анализа.
4) разработка методов количественной оценки АТ-Ш - нефелометри-
ческого и турбидиметрического анализа, метода латексной агглютинации.
Научная новизна. Разработаны оригинальные способы выделения и очистки АТ-Ш из нормальной донорской плазмы крови человека и из балластного осадка IV-I - отхода производства препаратов крови человека спиртовым фракционированием по методу Кона. Проанализировано содержание АТ-Ш в различных видах сырья и во фракциях всех этапов очистки белка. Показана принципиальная возможность использования в качестве источника антигенного материала АТ-Ш балластного осадка IV-I. Получены новые иммунохимические реагенты для количественной оценки АТ-Ш в плазме крови человека: поликлональная и моноклональная кроличья антисыворотка, очищенная гамма-фракция к АТ-Ш, стандартная сыворотка крови, оттитрованная по имеющемуся аналогу фирмы "Behring" (Германия).
Разработаны и апробированы серологические методы определения уровня АТ-Ш - нефелометрии, турбидиметрии, латексной агглютинации, иммуноферментный анализ. Показана диагностическая и прогностическая ценность оценки уровня АТ-Ш у больных, включенный в группы риска коагулопатий.
Практическая значимость работы. Определены оптимальные режимы получения АТ-Ш, специфических антигенов, антисывороток и гамма-фракции антител для фотометрии. На основе полученных реагентов отработаны
методики проведения нефелометрического, турбидиметрического анализа и латексной агглютинации для определения количества антикоагулянта в сыворотке доноров.
Проведенное обследование больных показало возможность дифференциальной диагностики, прогноза терапевтической коррекции системы гемостаза, возможных осложнений при гепаринотерапии, а также приобретенных и врожденных коагулопатий.
Внедрение в практику. На основе предварительно разработанных
способов выделения и очистки АТ-Ш из различных видов сырья получены и
внедрены в биотехнологическую практику следующие новые
иммунохимические реагенты для определения АТ-Ш :
-
"Антисыворотка диагностическая против АТ-Ш человека сухая преципитирующая" и "Антисыворотка диагностическая против АТ-Ш человека преципитирующая сухая".
-
Латексная тест-система для определения АТ-Ш в плазме крови.(Экспериментально производственный регламент).
Апробация диссертации. Материалы исследований доложены на " международной конференции "Экологическая патология и ее фармакокоррекция" (Чита, 1991), на межвузовской конференции "Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза" (Полтава, 1993), на Всероссийской конференции "Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники" (Чита, 1995), на Всероссийской научной конференции "Экологические интоксикации: биохимия, фармакология, клиника" (Чита, 1996).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и 14 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 90 отечественных и 105 зарубежных.
