Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Бальнеотерапия в лечении хронического тонзиллита и хронического фарингита
1.1. Хронический тонзиллит и хронический фарингит как общемедицинская проблема 10
1.2. Микробиологические аспекты хронического тонзиллита и хронического фарингита 13
1.3. Иммунологические аспекты хронического тонзиллита и хронического фарингита 17
1.4. Немедикаментозные методы терапии хронического тонзиллита и хронического фарингита 24
1.5. Сероводородные минеральные воды: опыт применения 29
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1. Общая характеристика сероводородной минеральной воды 35
2.2. Микробные культуры и методики микробиологических экспериментов 37
2.3. Клинико-лабораторные наблюдения 43
2.4. Биометрический анализ 48
2.5. Методика применения сероводородной минеральной воды 48
Глава 3. Характеристика антимикробных свойств сероводородной минеральной воды курорта «Усть-Качка» 49
3.1. Влияние сероводородной минеральной воды на выживаемость микробных культур 49
3.2. Влияние сероводородной минеральной воды на скорость роста микроорганизмов 52
3.3. Влияние сероводородной минеральной воды на уровень чувствительности микробных культур к антимикробным препаратам 55
3.4. Влияние сероводородной минеральной воды на экспрессию факторов вирулентности бактериальных культур 61
Глава 4. Анализ результатов клинического применения сероводородной минеральной воды в лечении хронического тонзиллита и хронического фарингита 67
4.1. Общая характеристика обследуемого контингента 68
4.2. Динамика клинических показателей при использовании сероводородной минеральной воды для местного водолечения 69
4.3. Микробиологические результаты использования сероводородной минеральной воды при хроническом фарингите и хроническом тонзиллите 71
4.4. Результаты изучения уровня лизоцима у пациентов до и после местного использования сероводородной минеральной воды 81
4.5. Динамика концентрации цитокинов в слюне при использовании сероводородной минеральной воды 83
4.6. Механизмы клинических эффектов использования сероводородной минеральной воды в реабилитации длительно и часто болеющих детей 85
Заключение 86
Выводы 94
Практические рекомендации 95
Список литературы .
- Микробиологические аспекты хронического тонзиллита и хронического фарингита
- Немедикаментозные методы терапии хронического тонзиллита и хронического фарингита
- Микробные культуры и методики микробиологических экспериментов
- Влияние сероводородной минеральной воды на скорость роста микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Важной проблемой восстановительной медицины в настоящее время остается оптимизация нелекарственной терапии хронических воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей. Эта патология широко распространена, особенно среди детей: так, хроническим тонзиллитом в РФ страдает до 26,4% детей (Богомильский М.Р., 2010). В ряде работ предлагаются методы лечения ХТ и ХФ, основанные на применении природных и преформированных лечебных факторов: минеральных вод (Закачурина И.В., 2006; Кривов В.А., 2008), морской воды (Вавилова В.П., 2010), солей и солевых растворов (Абдрахманов А.Р., 2004, Авербух Е.А., 2006), фитопрепаратов (Рябинова Е.Л., 2010). Авторы указывают, что МВ различного состава, обладая комплексными лечебными возможностями, дают хорошие результаты в терапии ХТ и ХФ. Однако в таких работах практически не используются сероводородные МВ, хотя эти воды считаются одной из наиболее важных групп МВ специфического состава, использующихся в России для бальнеолечения (Адилов В.Б., 2007). Следовательно, исходя из их высокой биологической активности, применение сероводородных МВ в терапии ХТ и ХФ было бы оправдано.
Цель исследования – изучить эффективность применения сероводородной содержащей бром и бор минеральной воды в лечении хронических тонзиллитов и фарингитов.
Задачи исследования:
1. Проведение экспериментального исследования антимикробных свойств сероводородной содержащей бром и бор минеральной воды, включающего оценку ее влияния на клинически значимые характеристики микроорганизмов.
2. Изучение клинической эффективности местного применения сероводородной содержащей бром и бор минеральной воды при хроническом тонзиллите и хроническом фарингите.
3. Изучение динамики микробной колонизации небных миндалин у пациентов с хроническим тонзиллитом и фарингитом при лечении сероводородной минеральной водой.
4. Оценка локальных показателей иммунного статуса (лизоцимная активность и цитокиновый профиль слюны) у пациентов с хроническим тонзиллитом и фарингитом при местном лечении сероводородной минеральной водой.
5. Биометрический анализ полученных данных с целью выявления признаков-предикторов эффективности лечения и определения показаний для применения исследуемой воды в комплексном лечении больных хроническим тонзиллитом и фарингитом.
Научная новизна
В экспериментальных условиях оценено влияние изученной СМВ на ряд характеристик микробных культур. Показано, что исследуемая вода обладает антимикробной активностью, поскольку контакт СМВ с культурами бактерий и грибков приводит к замедлению их темпов размножения на питательных средах.
Исследовано влияние СМВ на уровень чувствительности культур грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжеподобных грибков к антибиотикам. Показано, что в результате контакта микроорганизмов с СМВ происходит повышение уровня их чувствительности к антимикробным препаратам. Также впервые показано, что контакт микроорганизмов с СМВ может приводить к снижению выработки некоторых факторов вирулентности (гемолизина и лецитовителлазы).
Изучен комплекс клинических, микробиологических и иммунологических показателей при включении местной бальнеотерапии ХТ и ХФ с применением СМВ в общий оздоровительный комплекс для длительно и часто болеющих детей. Анализ показал, что введение курса местного водолечения приводит к редукции симптомов воспаления верхних дыхательных путей (более чем в 2 раза по визуально-аналоговой шкале), понижению общего уровня микробной колонизации небных миндалин более чем в 10 раз, а также достоверному снижению концентрации провоспалительного цитокина ИЛ-1 в слюне. Подобной динамики не наблюдалось у пациентов группы сравнения, где данное лечение не проводилось.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные данные расширяют представление о влиянии СМВ на свойства клинически значимой микрофлоры, развивают новое направление, раскрывающее саногенетические механизмы бальнеотерапии, обусловленные антимикробной активностью минеральной воды.
Практическая значимость исследования состоит в том, что на основе микробиологических, клинических и лабораторных исследований предложена новая методика для лечения хронических фарингитов и тонзиллитов. Показано, что введение разработанной технологии в комплекс реабилитационных мероприятий повышает эффективность восстановительного лечения при данных заболеваниях, что повышает лечебный потенциал курортов, использующих сероводородные источники.
Проведенные исследования показывают перспективы комплексного клинико-микробиологического анализа эффективности МВ, основанного на оценке их антимикробной активности, а также использовании бактериологических подходов в оценке эффективности бальнеотерапии.
Внедрение результатов исследования
Предложенный способ лечения хронического тонзиллита и фарингита с использованием СМВ курорта «Усть-Качка» внедрен в практику работы Центра восстановительного лечения Городской детской клинической поликлиники №6. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре факультетской терапии, клинической фармакологии, физиотерапии и традиционных методов лечения, кафедре оториноларингологии, а также на кафедре микробиологии и вирусологии Пермской государственной медицинской академии.
Положения, выносимые на защиту
1. Сероводородная минеральная вода обладает антимикробной активностью, что проявляется в замедлении темпов развития культур условно-патогенных микроорганизмов, а также в снижении выработки ими факторов вирулентности. Воздействие исследуемой минеральной воды повышает чувствительность бактериальных и грибковых культур к антимикробным препаратам.
2. Применение сероводородной минеральной воды в комплексной терапии хронических фарингитов и тонзиллитов повышает эффективность лечения.
3. При использовании сероводородной минеральной воды в комплексном лечении хронических фарингитов и тонзиллитов наблюдается нормализация показателей локального иммунного статуса (лизоцимной активности и цитокинового профиля слюны).
Апробация работы
Основные положения работы представлены и обсуждены на итоговых научных конференциях Пермской государственной медицинской академии (Пермь, 2011, 2012 и 2013 г.г.), Всероссийской школе молодых микробиологов и иммунологов (Пермь, 2011), межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 75-летию ЗАО «Клинический курорт Усть-Качка» (Пермь – Усть-Качка, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Санаторно-курортное лечение и медицинская реабилитация», посвященной 75-летию курорта «Янган-Тау» (Янган-Тау, 2012).
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Получено 3 патента на изобретения.
Диссертационная работа апробирована на совместном заседании кафедры факультетской терапии, физиотерапии, курортологии и традиционных методов лечения, кафедры микробиологии и вирусологии, а также Центральной научно-исследовательской лаборатории Пермской государственной медицинской академии 20 мая 2013 года.
Связь работы с научными программами и личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГБОУ ВПО ПГМА им.ак. Е.А.Вагнера Минздрава России (номер госрегистрации 01.2.00709665). Автор участвовал в проведении клинических и экспериментальных исследований, им лично проведена статистическая обработка материала, проведен анализ историй болезни пациентов, оценена эффективность использования сероводородной минеральной воды в лечении хронического тонзиллита и фарингита.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 217 источников, из них 126 отечественных и 91 – зарубежный. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 26 рисунками.
Микробиологические аспекты хронического тонзиллита и хронического фарингита
Микробный биоценоз миндалин через механизм конкурентного взаимодействия с патогенными бактериями является одним из важнейших компонентов системы местного иммунитета [121]. Основными представителями нормального микробиоценоза ротоглотки являются стрептококки и лактобациллы [73]. Однако частое применение антибиотиков и антисептиков у ДЧБ способствуют стойкому нарушению микробиоценоза и создают предпосылки для колонизации носоглотки высокопатогенной микрофлорой [32, 75, 121, 137, 138, 145]. Исходя из этого, высвечивается важность механической элиминации антигенных структур микроорганизмов с поверхности слизистой как компонента лечения, в частности, различными растворами. Еще один важный для практики вывод – именно лактосодержащие пробиотики являются наиболее актуальными в коррекции орального микробиоценоза [64]. В литературе указывается на важность применения микробиологических показателей как свидетелей снижения сенсибилизации организма компонентами микрофлоры лакун НМ [47, 62, 88, 104]. Однако единства позиций в отношении трактовки болезнетворности (или, напротив, безвредности) того или иного микроорганизма нет ни среди клиницистов, ни среди микробиологов.
По мнению ряда западных авторов [136, 138], представителями индигенной микрофлоры являются нейссерии (кроме 2-х патогенов) и некоторые виды -зеленящих стрептококков (Str.salivarius, Str.vestibularis, Str.faecium, Str.mitis). Другие же виды -зеленящих стрептококков (Str.mutans, Str.oralis, Str.suis) данные авторы считают среднепатогенными, а их присутствие трактуется ими как дисбиотическое состояние, что не совсем объяснимо. Группа авторов, представляющих кафедру ЛОР болезней РГМУ (зав.кафедрой – заслуженный деятель науки РФ, член-корр. РАМН профессор В.Т.Пальчун) приводит нормативные уровни присутствия основных родов и видов бактерий на задней стенке глотки (табл.1.1)[41]. Однако авторы указывают, что при анализе микробного пейзажа слизистой оболочки ВДП в норме и при гнойно-септических заболеваниях всегда следует осторожно трактовать результаты с учетом патогенного потенциала выделенных штаммов, их локализации и концентрации в организме хозяина.
Считается, что можно разделить все присутствующие в ВДП микроорганизмы по уровням приоритетности в развитии заболеваний респираторного тракта. К патогенам высокого уровня приоритетности в ЛОР-практике традиционно относят золотистый и эпидермальный стафилококк, синегнойную и кишечную палочку; средний уровень приоритетности присущ дрожжеподобным грибам, пиогенному и зеленящему стрептококку, энтерококкам [52].
Другая группа отечественных исследователей (Тулупов, 2011) основными представителями бактериальных патогенов при ХТ считает S.aureus, K.pneumoniae, M.catarrhalis и H.influezae [121]. Порогом диагностической значимости данные авторы считают уровень 104 КОЕ/мл. Еще одна точка зрения заключается в ведущей роли S.aureus как патогена, который по их данным, чаще выделяли в ассоциации с грамотрицательными бактериями или грибковой флорой [40]. Впрочем, этиологическим фактором могут являться и атипичные бактерии: микоплазмы и хламидии [149]. Важно, что все авторы подчеркивают важность микробиологических результатов для адекватной терапии заболеваний ЛОР органов и прогнозирования клинического течения гнойно-воспалительных заболеваний [47, 62].
Однако такое деление выглядит весьма условным, поскольку эти же авторы отмечали гораздо более высокую резистентность коагулазоотрицательных стафилококков к антибиотикам, нежели S.aureus. Поэтому патогенность микроорганизма, помимо классического подхода, вернее определять как функцию приспособления микроба к организму хозяина, базисом которой является перестройка метаболизма самого возбудителя [56]. Таким образом, с патогенностью очень тесно соприкасается такое свойство, как «персистенция» [27,28, 29]. В качестве примера важности последней характеристики можно привести известный факт, что стрептококки, длительно пребывавшие в организме носителей, становятся способны к внутриклеточной персистенции [63, 98].
В настоящее время становится доступной оценка коммуникативной активности микроорганизмов в нормо- и патоценозах. Показано, что у здоровых лиц компоненты микробиоценозов слизистых оболочек носа и миндалин не влияют на патогенный и персистентный потенциал друг друга, тогда как у больных людей формируется патологическая направленность микробов в данных биоценозах [28, 111].
В качестве другого примера можно привести описание коагулазоотрицательных стафилококков, выделенных из ВДП, которые в значительном проценте случаев обладали факторами патогенности. Так, 81 % из них обладал гемолитической активностью, 37% - лецитиназной активностью, 43% - липазой, 53% - коллагеназой. Таким образом, коагулазоотрицательные стафилококки оказались весьма вирулентными, что позволяет рассматривать их в качестве этиологических агентов, способных вызвать вторичные воспалительные заболевания ЛОР органов [56].
Еще один важный с клинической точки зрения момент связан с образованием микроорганизмами пленок на поверхности слизистых. Низкая эффективность антибиотикотерапии при ХТ может быть связана именно с образованием смешанных биопленок в криптах НМ [63]. Такие биопленки, образованные сообществом микроорганизмов, устойчивы к воздействию врожденных и адаптивных факторов иммунитета, а также к антимикробным препаратам [141].
Немедикаментозные методы терапии хронического тонзиллита и хронического фарингита
В настоящее время в клиническую практику все более активно внедряются немедикаментозные методы лечения. Это связано с недостаточной активностью традиционных лекарственных средств, ростом аллергизации населения, неблагоприятными последствиями длительной антимикробной терапии. Например, использование системных антибиотиков имеет ряд нежелательных последствий: подавление различных звеньев иммунитета, дисбактериоз, аллергические реакции и т.д. [13, 36, 42]. Причиной хронических инфекционных заболеваний ЛОР органов чаще являются не дефекты иммунной системы, а перенапряжение и истощение адаптационно-приспособительных механизмов и нарушение гомеостаза иммунной системы [92, 119]. Следовательно, немедикаментозные методы коррекции адаптационно-приспособительных реакций как метод выбора при лечении ЧБД могут быть использованы [22]. В частности, как метод немедикаментозного лечения ХТ предлагается использовать различные комплексные фитопрепараты [104].
Препараты для местного лечения фарингита не должны оказывать токсического и раздражающего действия на слизистую оболочку, должны иметь низкую скорость абсорбции, обладать широким спектром антимикробного действия, по возможности, включающим противогрибковую и антивирусную активность [21]. Микробный биоценоз миндалин через механизм конкурентного взаимодействия с патогенными бактериями является одним из важнейших компонентов системы местного иммунитета [121]. Однако частое применение антибиотиков и антисептиков у ДЧБ способствуют стойкому нарушению микробиоценоза и создают предпосылки для колонизации носоглотки высокопатогенной микрофлорой [91, 121, 137, 138, 154]. Следовательно, необходима коррекция микробного сообщества миндалин. Пробиотические препараты на основе лактобацилл достоверно снижают уровень УПМ в глотке [18, 64], помогают безопасно и эффективно скорректировать доклинические сдвиги в структуре микрофлоры (в том числе и микрофлоры ВДП), развивающиеся вследствие снижения колонизационной резистентности [64, 73, 90] . Другой важный по значимости подход, на который уже обращалось внимание – механическая элиминация микроорганизмов и их антигенных структур с поверхности слизистой оболочки миндалин, в частности, различными растворами. Так, предлагается использование препаратов (преимущественно, спреев), содержащих стерильную морскую воду (Аква Марис, Аквалор). При этом поясняется, что в комплекс их лечебно-профилактических воздействий входят смывание бактерий, активация функций мерцательного эрителия, активация бокаловидных клеток на выработку слизи за счет микроэлементов, входящих в состав. Так, ионы цинка и селена стимулируют выработку лизоцима, интерферонов и иммуноглобулинов [30].
Единичные исследования, проведенные в России и в Западной Европе, показали высокую эффективность орошений стерильной морской водой в лечении патологии носоглотки у детей [30, 121, 191]. Как вариант возможно использование гипертонического раствора. После двухнедельного курса местной терапии гипертоническим раствором авторы отметили умеренную положительную динамику (снижение концентрации или исчезновение патогенных видов бактерий). Делаются выводы о возможности применения гипертонического раствора как средства монотерапии, позволяющего минимизировать частоту применения местных форм антибактериальных препаратов [121]. Это, в свою очередь, позволяет снизить негативное воздействие на индигенную микрофлору носоглотки, играющую одну из важных ролей в формировании местного иммунитета верхних дыхательных путей. В литературе можно встретить информацию об использовании для лечения ХТ и ХФ таких оригинальных факторов, как искусственные минеральные воды [3, 112]. Однако, исходя из необходимости комплексного подхода к терапии и профилактике ХТ и ХФ, оптимальным является санаторно-курортное лечение [17, 39, 46, 58], где реальным становится использование всей совокупности лечебных воздействий – экологических, природных, бальнеологических и медикаментозных факторов, режима и диеты, кинезотерапии, массажа и т.д. Среди методов восстановительного лечения весомая роль отводится питьевой и местной бальнеотерапии как наиболее физиологичному из немедикаментозных методов. Бальнеолечение способно оказывать комплексное влияние на различные патогенетические звенья воспалительных заболеваний [19, 101].
Среди методов консервативного лечения при ХТ наиболее эффективно промывание лакун миндалин. Промывание миндалин обеспечивает механическую очистку лакун от экссудата и патологических агентов. Водная струя оказывает определенный эффект массажа слизистой, стимулируя естественный процесс ее самоочищения и улучшает кровоснабжение [71, 110, 127]. Также достаточно эффективным, доступным и патогенетически обоснованным способом бальнеолечения является ингаляционная терапия. Использование для ингаляционной терапии природных естественных факторов – минеральных вод – позволяет уменьшить риск возникновения аллергических реакций, повысить эффективность базисной медикаментозной терапии. В ряде исследований показано, что применение МВ ускоряло положительную клиническую динамику по всем использованным показателям (общее состояние, интенсивность кашля и местных симптомов, фарингоскопическая и аускультативная картина), существенно улучшало результаты повторных микробиологических исследований [19, 72, 113]. Иммунологические исследования доказали, что применение минеральных вод у больных с воспалением верхних дыхательных путей улучшало цитологическую картину (уменьшалось количество бактерий при возрастании уровня плазматических клеток), повышало фагоцитарную активность нейтрофилов и оказывало комплексный иммуномодулирующий эффект [31, 107].
Микробные культуры и методики микробиологических экспериментов
При выборе тест-культур микроорганизмов руководствовались, с одной стороны, наличием клинической значимости у использованных в экспериментах видов, а с другой старались охватить многообразие микроорганизмов, различающихся по строению клеточной стенки, метаболизму и, следовательно, по механизмам реализации возможных антимикробных (микробицидных и микробостатических) эффектов. Последнее особенно важно при изучении таких сложных многокомпонентных систем, какими являются минеральные воды и другие природные факторы, используемые в практической курортологии [99]. В экспериментах использовали следующие музейные культуры: 1. Грамотрицательные бактерии: - Escherichia coli ATCC 25922; - Proteus vulgaris ССМ 1799. 2. Грамположительные бактерии: - Staphylococcus aureus ATCC 25923; - Staphylococcus aureus ATCC 29213. 3. Дрожжеподобные грибки: - Candida albicans ATCC 10231.
В экспериментах использовали суточные культуры тест-штаммов, выращенные на питательном агаре (ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск). С помощью стерильного ИХН готовили смывы со скошенных агаров, после чего проводили стандартизацию полученных взвесей с помощью стандарта мутности ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича до плотности, соответствующей 5 ЕД.
Изучали следующие показатели антимикробной активности СМВ: - выживаемость микробных культур в исследуемой воде; - влияние СМВ на скорость роста микробов на плотных средах; - воздействие СМВ на уровень чувствительности к антибиотикам; - влияние СМВ на выраженность факторов вирулентности. Выживаемость микроорганизмов в СМВ оценивали при минимальной концентрации сероводорода (50 мкг/л), проводя инкубацию культур в исследуемой воде при 37о С с ежечасными высевами [53]. Для этого в стерильные стеклянные флаконы вносили по 1 мл стандартизованной по оптическому стандарту мутности взвеси тест-культур (E.coli ATCC 25922, S.aureus ATCC 25923 и C.albicans ATCC 10231), а также 100 мл исследуемой СМВ. В контрольные емкости вместо СМВ добавляли 100 мл стерильного ИХН. После заполнения флаконов их содержимое перемешивали; флаконы помещали в термостат и инкубировали при температуре 37о С. Забор проб осуществляли через 1, 2, 3, 4, 6, 23 и 24 часа контакта. Флаконы извлекали из термостата, встряхивали содержимое и отбирали по 1мл смеси. Из проб готовили серийные десятикратные разведения от 10 -1 до 10-5 в стерильной посуде с использованием стерильного ИХН и дозаторов со сменными стерильными наконечниками. Далее из каждого разведения проводили дозированные высевы в объеме 10 мкл капельным методом на чашки с питательным агаром [82]. Каждое разведение пробы засевали трехкратно для повышения достоверности результатов. Чашки помещали в термостат для инкубации при температуре 37о С на 24 часа –для бактериальных культур или 48 часов –для культуры дрожжеподобных грибков. Учет результатов проводили путем подсчета количества выросших колоний, подсчета плотности микробов в взвеси и сопоставления опытных данных с аналогичными контрольными показателями.
Во всех остальных экспериментах предварительно проводили приготовление взвесей суточных культур по описанной выше методике и делили их на 2 равные части. Первую (опытную) часть вносили в емкость с СМВ различной концентрации. Контакт культур с сероводородной водой осуществляли в термостате в течение 30 мин при температуре 37о С. Вторая (контрольная) часть микробной взвеси в аналогичных условиях контактировала с ИХН. Далее взвеси культуры отмывали от СМВ путем добавления физиологического раствора и центрифугирования и стандартизовали с помощью стандарта мутности ГИСК, после чего осуществляли непосредственно эксперименты.
Влияние СМВ на скорость роста микроорганизмов на плотных средах оценивали по диаметру колоний, выросших на питательном агаре. Из опытных и контрольных взвесей микробных культур готовили десятикратные разведения в стерильной посуде с использованием стерильного ИХН и дозаторов со сменными стерильными наконечниками. На чашки Петри с питательным агаром производили посевы, рассчитанные таким образом, чтобы на чашке образовалось не более 10-15 колоний (для исключения взаимного влияния колоний друг на друга). Чашки помещали в термостат для инкубации при температуре 37о С на 24 часа (чашки с грибковой культурой – на 48 час) После инкубации измеряли диаметр колоний с помощью микроскопа МБС-2 с окуляр-микрометром [83]. При изучении влияния СМВ на уровень чувствительности бактериальных и грибковых культур к антимикробным препаратам использовали дискодиффузионный метод, в том числе, в варианте «двойных дисков» [87]. Стандартизованные по оптической плотности опытные и контрольные взвеси засевали на чашки Петри со средой Мюллера-Хинтона (ЗАО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», Санкт-Петербург), после чего накладывали диски с антибиотиками (ЗАО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», Санкт-Петербург). Для нивелирования возможного влияния толщины питательной среды на результаты опытные и контрольные взвеси одного вида засевали на половинки одной чашки Петри. В экспериментах с грамотрицательными бактериями использовали рекомендованные вышеуказанным руководством антибиотики: ампициллин, цефотаксим, гентамицин, ципрофлоксацин, в опытах с грамположительными бактериями – оксациллин, цефазолин, гентамицин, ципрофлоксацин и линкомицин. У грибковой культуры оценивали чувствительность к нистатину, амфотерицину, итраконазолу и клотримазолу.
Влияние сероводородной минеральной воды на скорость роста микроорганизмов
Сопоставление графиков выживания бактериальных культур (рис.3.1 и 3.2) продемонстрировало их подобие, что можно считать отражением общности механизмов адаптации у грамположительных и грамотрицательных бактерий. В сравнении с ними культура дрожжеподобных грибов, имеющая более высокий уровень организации, в первые 2 часа сохраняла жизнеспособность в большей степени (рис. 3.3). Таким образом, в данных экспериментах изучаемая вода проявила себя как среда, малоблагоприятная для сохранения жизнеспособности микроорганизмов при постоянном контакте с ними. Имевшиеся различия между показателями экспериментов №№1-3 не носили существенного характера и были связаны, на наш взгляд, с методологическими особенностями подготовки данных опытов. Действительно, стандартизация микробных взвесей с помощью стандартов мутности всегда предполагает определенную погрешность в получаемой концентрации клеток, что и отразилось в результатах. Поскольку в реальных условиях бальнеолечения контакт пациента (а, следовательно, и его микрофлоры) с минеральной водой продолжается гораздо меньший отрезок времени (от 5-8 до 20-30 мин), изучение влияния СМВ на микробные культуры при краткосрочном контакте представляло больший интерес с точки зрения клинической значимости полученных результатов. Поэтому в последующих опытах экспозиция смеси культура+СМВ составляла 30 мин.
В данном разделе экспериментов для оценки антимикробных свойств СМВ мы использовали интегральный показатель скорости роста микробных культур на плотных средах – диаметр колоний. Это давало возможность обнаружить антибактериальный или противогрибковый эффект вне зависимости от его механизма, поскольку любое неблагоприятное воздействие в конечном счете снизит скорость роста микробной культуры. Для того, чтобы нивелировать возможные неучтенные влияния на скорость формирования колоний (различия в трофических свойствах разных партий сред, различная толщина агара в чашках и т.п.), каждую пару культур: контрольную и опытную - засевали на половинки одной и той же чашки.
Полученные и представленные здесь результаты подтверждали наше предположение о том, что диаметр колоний у микробов, контактировавших с СМВ, должен быть достоверно ниже по сравнению с контрольными культурами, контактировавшими с физиологическим раствором (р 0,05).
Однако в связи с тем, что музейные микробные культуры представляют собой особую выборку бактерий и грибов, зачастую выделенную и идентифицированную многие десятилетия тому назад, а потому существенно отличающуюся от «современной» микрофлоры, данный раздел экспериментального исследования был дополнен аналогичными опытами, в которых использовали клинические изоляты, выделенные из верхних дыхательных путей детей - пациентов одной из детских больниц г.Перми.
Следует сразу отметить, что полученные при этом данные не несли принципиальных отличий от вышеописанных. Выделенные из мазков с небных миндалин больных детей культуры, подобно музейным, после контакта с СМВ образовывали на плотной среде колонии, имеющие достоверно меньший диаметр (табл.3.5, рис. 3.5). Т а б л и ц а 3.5
Средний диаметр колоний «клинических» культур микроорганизмов на плотной питательной среде, Опыт / Контроль, мм (М ± m) S.epidermidis(4 культуры) Str.pyogenes(3 культуры) E.coli (4 культуры) P.aeruginosa (3 культуры) C.albicans (4 культуры) культура № 1 2,20±0,03/2,48±0,02 __ 2,48±0,03/2,90±0,04 2,63±0,04/3,10±0,03 1,69±0,03/2,03±0,02 культура № 2 1,64±0,03/2,07±0,03 __ 2,68±0,03/3,07±0,03 2,60±0,03/2,94±0,09 1,72±0,04/2,12±0,03 культура № 3 1,93±0,03/2,24±0,04 __ 2,84±0,15/3,20±0,07 2,78±0,03/3,16±0,03 1,86±0,09/2,10±0,08 культура № 4 1,84±0,05/2,03±0,09 __ 2,62±0,08/2,94±0,09 __ 1,96±0,07/2,26±0,07 - различия опыт/контроль статистически значимы по критериям Стьюдента и Уилкоксона ( р 0,05). - культуры Str.pyogenes после контакта с СМВ роста не дали. Рис.3.5. Средний диаметр колоний после контакта микробных культур, выделенных из клинического материала, с СМВ (опыт) или физиологическим раствором (контроль), мм. Таким образом, контакт с СМВ в течение 30 минут оказался для микробных культур достаточно сильным фактором, действие которого сохранялось на протяжении 24 часов инкубации и проявилось в замедлении скорости роста на плотной питательной среде. Действие СМВ оказалось эффективным как для музейных, так и для клинических культур, а также достаточно универсальным, поскольку распространялось и на грибковые, и на бактериальные культуры (у последних оно не зависело от особенностей строения бактерий).
Результаты исследований влияния СМВ на уровень антибиотикочувствительности бактериальных и грибковых культур (см. рис. 3.6, 3.7, 3.8 и 3.10) свидетельствовали о статистически значимом повышении чувствительности микробов к препаратам после контакта с исследуемой сероводородной водой (уровень значимости различий - в табл. 3.6).
Динамика уровня чувствительности к антибиотикам культуры Е.coli ATCC 25922 под влиянием сероводородной МВ, зоны угнетения роста, мм Этот эффект отмечали как у грамположительных бактерий (коэффициент влияния от 1,10 до 1,18), так и у грамотрицательных бактерий (коэффициент влияния от 1,10 до 1,22) - см. табл. 3.6.
Динамика уровня чувствительности к антибиотикам культуры Pr.vulgaris ССМ 1799 под влиянием сероводородной МВ, зоны угнетения роста, мм
Как видно из графиков, наблюдались различия в уровнях чувствительности ко всем антибиотикам, независимо от механизма их действия. Примечательно также, что достоверные различия опыт/контроль у всех микробных культур были получены при концентрации сероводорода 50 мг/л, то есть минимальной из реально применяемых в бальнеологической практике курорта «Усть-Качка». Однако мы решили проверить, будет ли наблюдаться зависимость эффектов воды от ее концентрации, и провели соответствующую серию экспериментов. Их результаты закономерно свидетельствовали о том, что с повышением концентрации СМВ различия между опытными и контрольными показателями чувствительности возрастают (в качестве примера приведены показатели чувствительности культуры Е.coli ATCC 25922 к ампициллину – рис.3.9).
Динамика уровня чувствительности к ампициллину культуры Е.coli ATCC 25922 под влиянием разных концентраций сероводорода в сероводородной МВ, процент превышения опытных показателей над контрольными, %
В-четвертых, для понимания механизмов влияния СМВ на уровень антибиотикочувствительности микробных культур важно оценить результаты взаимодействия минеральной воды и антибиотика при использовании метода «двойных дисков». Когда диск с антибиотиком и диск (или полоска) с минеральной водой накладывались на среду рядом, они одновременно диффундировали в питательную среду и одновременно воздействовали на микробные клетки. В результате зона угнетения роста культуры антибиотиком вытягивалась (удлинялась) в сторону полоски с минеральной водой. Эти результаты - самое наглядное подтверждение того, что исследуемая минеральная вода является синергистом антибиотиков при совместном действии на бактерии и грибы. Еще один важный момент - выявленное влияние СМВ на музейные культуры распространялось и на клинические культуры, выделенные от детей из стационара: во всех случаях после контакта с СМВ отмечалось повышение уровня чувствительности к антибиотикам (см. табл. 3.7)
Избранные нами в качестве маркерных признаков вирулентности способность бактерий вырабатывать и выделять гемолизины, а также лецитовителлазная активность являются одними из наиболее часто встречающихся и универсальных по механизму своего патофизиологического эффекта факторов патогенности микроорганизмов. Гемолизины более правильно следовало бы называть мембраноповреждающими токсинами, поскольку действие этих микробных экзометаболитов достаточно многообразно: они способны разрушать не только эритроциты, но и лейкоциты, тромбоциты и клетки различных тканей организма человека [43, 103]. Поскольку синтез гемолизинов может детерминироваться внехромосомными (плазмидными) факторами наследственности, гемолитическая активность все шире встречается среди условно патогенных бактерий. Лецитовителлаза (лецитиназа) – фермент, обладающий способностью разрушать фосфолипиды цитоплазматической мембраны (лецитин) клеток организма человека. Он также широко распространен среди клинически значимой микрофлоры и присущ не только грамположительным коккам, но и бациллам; обнаруживается также у различных грамотрицательных палочек: энтеробактерий и неферментирующих грамотрицательных бактерий [43, 103].
