Содержание к диссертации
Список сокращений и условных обозначений 5
Введение 6
Обзор литературы 16
Глава 1 Иммунологические особенности получения гетерологичной
антирабической плазмы 16
Характеристика вирусного антигена и субстрата для репродукции вируса бешенства 16
Применение адъювантов для получения специфичной плазмы 21
Зависимость антительного ответа от дозы, интервалов и методов введения вирусного антигена 25
Глава 2 Технологические особенности получения препаратов С"
гетерологичных иммуноглобулинов и их характеристика 32
Методы получения гетерологичных иммуноглобулинов 32
Состав и характеристика препаратов гетерологичных иммуноглобулинов 39
Собственные исследования 44
Глава 3 Материалы и методы исследований 44
Материалы исследования 44
Методы исследования 45
Глава 4 Разработка способа получения высокоспецифичной лошадиной
антирабической плазмы 49
Изучение влияния степени очистки вирусного антигена на качественные характеристики гетерологичного антирабического иммуноглобулина 49
Разработка метода истощения антител к антигенам клеток почек сирийского хомяка из реактогенной антирабической плазмы 53
Изучение влияния дозы вирусного антигена на специфическую активность антирабической плазмы 57
Разработка количественного метода определения антигенов клеток почек сирийского хомяка . 62
Изучение влияния различных адъювантов на специфическую активность антирабической плазмы 65
Определение оптимальной концентрации алюминия фосфата 67
Изучение зависимости титра специфических антител от дозы вируса бешенства, сорбированного на алюминия фосфате 70
Оценка влияния субстрата репродукции вируса бешенства
на специфическую активность антирабической плазмы 72
Глава 5 Разработка технологии получения высокоочищенного препарата
иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади 79
5.1 Изучение различных методов получения препарата
иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади 79
5.1.1 Получение иммуноглобулина с использованием ионообменной
хроматографии на DEAE-Toyopearl 79
5.1.2Получение иммуноглобулина антирабического из плазмы крови
лошади с использованием аммония сульфата 81
5.1.3Получение иммуноглобулина антирабического из плазмы крови
лошади с использованием риванола 83
5.1.4Получение иммуноглобулина антирабического из плазмы
крови лошади с использованием каприловой кислоты 85
5.1.5Сравнение качества иммуноглобулина антирабического из плазмы
крови лошади, полученного разными методами 87
5.2 Изучение влияния концентрации натрия хлорида и стабилизаторов -
мальтозы и глицина на качество конечного препарата
иммуноглобулина антирабического 90
5.3 Сравнение качества и стабильности разработанного
иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади с
коммерческими аналогами 94
Заключение 98
Выводы 106
Список литературы 108
Список сокращений и условных обозначений
АГ - антиген
АКА - антикомплементарная активность
АРИГ - антирабический иммуноглобулин
AT - антитело
БОЕ - бляшкообразующие единицы
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВКЖ - вируссодержащая культуральная жидкость
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения
ИГ - иммуноглобулин
КРС - крупный рогатый скот
МУК - методические указания
НПО - научно-производственное объединение
ОСО - отраслевой стандартный образец
ПДК - предельно-допустимая концентрация
ПСХ - почки сирийского хомяка
ПЭГ - полиэтиленгликоль
РИЭФ - ракетный иммуноэлектрофорез
РФ - Российская Федерация
ФГУП - Федеральное государственное унитарное предприятие
ЧАИГ - человеческий антирабический иммуноглобулин
СН50 - гемолитическая активность комплемента
WHO - World Health Organization
Введение к работе
Актуальность проблемы
По данным ВОЗ (2005), в мире ежегодно регистрируется от 35000 до 55000 случаев смерти людей от бешенства и около 500000 случаев активно-пассивной иммунизации [Connelly К.Р., 2004; Goudsmit J. et al., 2006]. При этом 99 % смертности от гидрофобии приходится на развивающиеся государства [WHO, 2005; Sriaroon С. et al., 2006; Sudarshan M.K. et al., 2007], где в числе погибших находятся лица, которым отказано в лечении из-за дефицита антирабических препаратов, в особенности антирабического иммуноглобулина [Рахимова Ф.И. и др., 1995]. Случаи человеческого бешенства имеют место даже в благополучных странах Европы и Америки [Krebs J.W. et al., 2005; Sadkowska-Todys M., Labunska E., 2005; O'Bell S.A. et al., 2006; Tomasiewicz K. et al., 2006]. Проблема гидрофобии актуальна и для РФ, где эпидемиологическая обстановка по бешенству характеризуется как неблагоприятная [Мовсесянц А.А., 2003; Онищенко Г.Г., 2003; Медуницын Н.В., 2004].
Во всем мире эпизоотологическая ситуация по бешенству обусловлена наличием постоянно действующих природных очагов рабической инфекции, из которых нереально искоренить вирус бешенства [Joshi D.D., Bogel К., 1988; Wunderli P.S. et al., 2006; Sudarshan M.K. et al., 2007], особенно среди летучих мышей [Warrell M.J., Warrell D.A., 2004; Morris J., Crowcroft N.S., 2006; Tordo N. et al., 2006], что представляет постоянную угрозу заражения людей вирусом бешенства [Ведерников В.А. и др., 2002; Макаров В.В., 2002].
Бешенство - острая нейроинфекция теплокровных животных, вызываемая рабдовирусом. Инкубационный период заболевания длится от двух недель до шести месяцев [Sudarshan M.K. et al., 2007]. Клиническая картина заболевания бешенством характеризуется тяжелым поражением нервной системы и без специфического лечения неизменно приводит к летальному исходу. Комитет
ВОЗ по бешенству рекомендовал применение АРИГ во всех случаях возможного заражения людей бешенством, так как профилактика бешенства одной антирабической вакциной не всегда эффективна [Suwansrinon К. et al., 2006; Tomasiewicz К. et al., 2006]. Препарат АРИГ входит в состав перечня ВОЗ (2000) основных лекарственных средств. Кроме того, длительная вакцинация часто сопровождается аллергическими реакциями на примесные компоненты антирабической вакцины [Медуницин Н.В., 2004; Sudarshan М.К. et al, 2005].
Гомологичный АРИГ из сыворотки крови человека отличается хорошей переносимостью [Suwansrinon К. et al., 2005]. Однако он почти недоступен из-за высокой стоимости и небольшого объема производства, которые обусловлены трудностями иммунизации волонтеров и недостаточностью сырьевой базы [Wilde Н., Chutivongse S., 1990; Pancharoen С. et al., 2001]. Кроме того, заготовка донорской крови все больше ограничивается расширением противопоказаний к сдаче крови из-за низких физиологических показателей доноров и роста инфекций, передающихся через кровь [Райхер Л.И., Райхер И.И., 1995].
Экономичнее (приблизительно в пять раз по сравнению с ЧАИГ) профилактика бешенства АРИГ из плазмы крови лошадей [Wilde Н et al., 1991; Pancharoen С. et al., 2001; Goudsmit J. et al., 2006]. Использование последнего поколения очищенного ксеногенного АРИГ намного безопаснее применения лошадиной антирабической сыворотки: частота побочных реакций уменьшилась до 1-2 % [WHO, 2005]. Высокоочищенный препарат АРИГ из плазмы крови лошади является эффективной, доступной, экономичной и относительно безопасной альтернативой гомологичному препарату антирабического иммуноглобулина [WHO, 2005; Sudarshan М.К. et al., 2007].
В настоящее время многие мировые производители из-за давления, которое оказывают на них защитники прав животных, отказались от производства препаратов гетерологичного антирабического иммуноглобулина [Wilde Н. et al., 2002]. В развивающихся странах производством ксеногенного
АРИГ занимаются национальные фармацевтические компании, препараты которых плохо очищены и характеризуются высокой реактогенностью, и не удовлетворяют национальные потребности [Wilde Н. et al., 1996, 2002; Sriaroon С. et al, 2006].
В России зарегистрированы два препарата иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади - производства ЗАО «Биолек» (Украина) и РосНИПЧИ «Микроб» (Россия), получаемые при иммунизации продуцентов штаммом фиксированного вируса бешенства «Москва» и обладающие достаточно высокой специфической активностью. Однако, согласно нормативно-технической документации, в этих препаратах допускается содержание примесных а- и р-глобулинов до 20 %, у-глобулинов -не менее 80 % [ФСП 42-412ВС-93; ФСП 42-0020441303], что свидетельствует о недостаточно высокой степени очистки препаратов и возможности дальнейшего совершенствования технологии получения иммуноглобулина. Кроме того, они не контролируются на степень агрегации и фрагментации иммуноглобулина, а также на осмолярность, которые являются показателями безопасности иммуноглобулиновых препаратов и могут быть причиной побочных реакций.
Существующие методы фракционирования не позволяют получить гетерологичный препарат АРИГ с высокой степенью концентрации AT, поэтому большое значение имеет разработка способов получения исходной высокоспецифичной антирабической плазмы. Трудности, связанные со способом получения специфической плазмы, таких как: невысокие иммуногенность и качество используемого для иммунизации вируса бешенства, невысокая специфическая активность гипериммунной плазмы, и проблемы фракционирования гетерологичных иммуноглобулинов [Sriprapat S. et al., 2003], ведут к ограниченному производству и высокой стоимости гетерологичных препаратов антирабического иммуноглобулина. Таким образом, оптимизация технологии получения высокоочищенного АРИГ из плазмы крови лошади
остается актуальной. На основании вышеизложенного была сформулирована цель и определены задачи настоящего исследования.
Цель исследования
Разработка иммунологических критериев качества и безопасности вирусного антигена и антирабической плазмы и оптимизация технологии получения высокоспецифичного и высокоочищенного препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади.
Задачи исследования
Определить причинность реактогенности гетерологичного антирабического иммуноглобулина в отношении иммунореактивных примесных компонентов антигена вируса бешенства: бычьего сывороточного альбумина, антигенов клеток почек сирийского хомяка и желатозы.
Разработать способ удаления из реактогенной антирабической плазмы антител к антигенам клеток почек сирийского хомяка - субстрату репродукции вируса бешенства.
Разработать требования к антигену вируса бешенства, предназначенного для иммунизации животных, и к гетерологичной антирабической плазме - сырью для получения препарата антирабического иммуноглобулина.
Оптимизировать технологию производства антирабического иммуноглобулина из плазмы крови лошади для получения высокоспецифичного и высокоочищенного F(ab)2-npenapaTa с физиологичной осмолярностью.
Сравнить разработанный препарат антирабического иммуноглобулина из плазмы крови лошади с коммерческими аналогами на соответствие требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим препаратам, и изучить стабильность качественных характеристик разработанного препарата во время хранения и транспортировки.
Научная новизна
Впервые показано, что реактогенность гетерологичного антирабического иммуноглобулина обусловлена присутствием в нем антител к антигенам клеток почек сирийского хомяка - субстрату репродукции вируса бешенства.
Впервые разработан способ удаления реактогенных антител к антигенам клеток почек сирийского хомяка, присутствующих в антирабической плазме, путем ее истощения нерастворимым антигеном клеток почек сирийского хомяка.
Установлены иммунологические критерии качества и безопасности антигена вируса бешенства, предназначенного для иммунизации лошадей, и антирабической плазмы - исходного сырья для получения препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади.
Впервые предложен контроль антигена вируса бешенства, предназначенного для иммунизации животных - продуцентов антирабической плазмы, на остаточное содержание в нем антигенов клеток почек сирийского хомяка методом ракетного иммуноэлектрофореза.
Впервые показано, что антиген вируса бешенства полученный на перевиваемой культуре клеток Vero, при равной иммуногенности с вирусом, репродуцированном на первичной культуре клеток почек сирийского хомяка, позволяет получать более высокий титр вируснейтрализующих антител.
Предложен оптимизированный способ получения ареактогенной высокоспецифичной гетерологичной антирабической плазмы (получен патент РФ).
Разработана технология производства стабильного высокоочищенного препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, в котором содержание Р(аЬ)2-фрагментов иммуноглобулина G составляет не менее 90 %, фракция у-глобулинов - более 90 %, а- и р-глобулинов -менее 10 %, специфическая активность - не менее 400 МЕ/мл, содержание
11 натрия хлорида - не более 0,45 %, физиологичная осмолярность - в пределах 250-350 мОсм/кг (приоритетная справка по заявке на изобретение РФ). Научно-практическая значимость работы
Для антигена вируса бешенства, предназначенного для иммунизации животных - продуцентов антирабической плазмы, установлены пороговые значения качественных характеристик: по остаточному содержанию антигенов клеток почек сирийского хомяка, иммуногенности вирусного антигена и концентрации адъюванта алюминия фосфата при сорбции вируса бешенства, что в производственных условиях позволяет получать ареактогенную высокоспецифичную лошадиную антирабическую плазму.
Метод ракетного иммуноэлектрофореза для контроля остаточного содержания антигенов клеток почек сирийского хомяка рекомендуется внести в фармакопейную статью предприятия на антирабическую вакцину, при получении которой в качестве субстрата репродукции вируса используется первичная культура клеток почек сирийского хомяка, что позволит повысить безопасность вакцин и получаемых с их помощью специфических иммуноглобулиновых препаратов.
Для получения антирабической вакцины рекомендована замена субстрата репродукции вируса бешенства с первичной культуры клеток почек сирийского хомяка на перевиваемую культуру клеток Vero, так как вирусный антиген, полученный на культуре клеток Vero, позволяет получать более высокий титр вируснейтрализующих антител.
Гипериммунизация лошадей низкими дозами сорбированного на алюминия фосфате вируса бешенства позволяет получить антирабическую плазму с высокой специфичной активностью и снизить затраты на вирусный антиген.
Контроль антирабической плазмы на реактогенность - внутривенное введение кроликам гипериммунной плазмы в дозе 10 мл/кг массы тела -
позволяет оценить качество исходного сырья.
Разработанный способ удаления антител к антигенам клеток почек сирийского хомяка путем истощения пула реактогенной антирабической плазмы нерастворимым антигеном клеток почек сирийского хомяка позволяет сохранить исходное сырье от выбраковки.
Модифицированная технология получения иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, с использованием комбинированного каприлатно-спиртового метода фракционирования с протеолизом, внесением натрия хлорида и стабилизаторов с учетом физиологичной осмолярности, позволяет получить высокоочищенный F(ab)2-npenapaT, который соответствует требованиям Европейской фармакопеи.
Высокие качественные характеристики и их контроль в разработанном антирабическом иммуноглобулине повышают безопасность препарата и позволяют предупредить возникновение возможных побочных реакций.
Внедрение результатов исследования в практику
На базе иммуноклиники и сывороточного цеха филиала
«Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ получены две
экспериментально-производственные серии лошадиной антирабической плазмы
и три экспериментально-производственные серии препарата иммуноглобулина
антирабического из плазмы крови лошади, которые прошли контроль в отделе
биологического и технологического контроля департамента качества филиала
«Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (г. Уфа). В проект
фармакопейной статьи предприятия на разработанный препарат
иммуноглобулина антирабического внесены методы контроля молекулярных
параметров, стабилизаторов - мальтозы и глицина, каприловой кислоты и
осмолярности. Проекты нормативно-технической документации
(Фармакопейная статья предприятия и Инструкция по применению препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади) одобрены
решением Ученого совета филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО
«Микроген» МЗ РФ (выписка из протокола № 4 заседания Ученого Совета от
19 сентября 2007 г). Метод ракетного иммуноэлектрофореза для контроля
остаточного содержания антигена клеток почек сирийского хомяка был
использован контрольно-аналитической лабораторией филиала
«Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ для выбора серий концентрированной очищенной кулыуральной антирабической вакцины, предназначенных для иммунизации лошадей.
По материалам исследований в Федеральный институт промышленной собственности поданы две заявки на изобретение: № 2006126555 «Способ получения высокоспецифичной гетерологичной антирабической сыворотки» (получено положительное решение о выдаче патента РФ от 3 сентября 2007 г., приоритет от 21.07.2006 г.) и № 2006141874 «Препарат гетерологичного антирабического иммуноглобулина для внутривенного и внутримышечного введения и способ его получения» (приоритет от 28.11.2006 г.).
Основные положения, выносимые на защиту
Выявлена причинная связь между реактогенностью гетерологичного антирабического иммуноглобулина и содержанием в нем антител к антигенам первичной культуры клеток почек сирийского хомяка - субстрату репродукции вируса бешенства.
Разработаны иммунологические критерии качества и безопасности вирусного антигена, предназначенного для иммунизации животных -продуцентов, и гетерологичной антирабической плазмы, предназначенной для получения антирабического иммуноглобулина.
Оптимизирована технология получения высокоочищенного, высокоспецифичного и стабильного препарата иммуноглобулина антирабического из плазмы крови лошади, включающая получение ареактогенной высокоспецифичной антирабической плазмы, фракционирование
каприлатно-спиртовым способом с протеолизом, позволившая получить F(ab)2-препарат с содержанием Р(аЬ)2-фрагментов иммуноглобулина не менее 90 %, электрофоретической чистотой не менее 90 %, со специфической активностью не менее 400 МЕ/мл, соответствующий требованиям Европейской фармакопеи.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на ряде научных форумов: Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа, 2000), VIII Международном конгрессе по иммунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть» (Канны, 2002), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (Пермь, 2003), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Томск, 2004), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004), I Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение» (Уфа, 2005).
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (протокол от 19.09.2007 г. № 4) и на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан (протокол от 04.10.2007 г. №64).
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 15 научных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 131 страницах, содержит 12 таблиц и 11 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (3 главы), заключения и выводов. Список литературы включает 209 источников (60 отечественных и 149 зарубежных).
