Содержание к диссертации
Введение
Часть 1. Обзор литературы
Глава 1. Апоптоз как форма гибели клеток 10
Глава 2. Моноклональные антитела против Fas/APO-І антигена
Часть II. Результаты собственных исследований и их обсуждение
Глава 1. Материалы и методы исследования 55
Глава 2. Получение моноклональных антител против CD95(Fas/APO-l) антигена, опосредующего апоптоз, и их характеристика .
Глава 3. Изучение возможности применения МКА ICO-160 для проведения иммунологического фенотипирования в клинической практике .
Заключение 158
Выводы 165
Список литературы 167
- Апоптоз как форма гибели клеток
- Моноклональные антитела против Fas/APO-І антигена
- Получение моноклональных антител против CD95(Fas/APO-l) антигена, опосредующего апоптоз, и их характеристика
- Изучение возможности применения МКА ICO-160 для проведения иммунологического фенотипирования в клинической практике
Введение к работе
Жизнь и смерть клеток контролируется мембранными рецепторами и их лигандами, которые активируют как процессы пролиферации, так и апоптоза. Апоптоз - это активный, генетически контролируемый процесс, который удаляет ненужные или поврежденные клетки. В результате такого взаимодействия обеспечивается нормальный гомеостаз в клетках при сохранении способности к быстрому увеличению клеточного состава, например в процессе развития клеток-предшественников, иммунного ответа или нормального гематопоэза. В настоящее время апоптоз привлекает внимание многих исследователей из-за его исключительной роли в жизнедеятельности многих организмов для обеспечения нормального функционирования иммунной системы и открытия вовлечения генов и молекул, которые регулируют этот процесс, в патогенез различных заболеваний. Показано, что повышенная резистентность к апоптозу может привести к созданию условий для злокачественного роста, например, при лимфопролиферативных заболеваниях и опухолях, неспособность к элиминации аутореактивных клеток может быть причиной аутоиммунных заболеваний. Усиленный апоптоз лежит так же в основе нейродегенеративных изменений, наблюдаемых при болезни Альцгеймера, при иммунодефицитных состояниях, СПИДе, апластической анемии.
Рецепторами смерти являются клеточно-поверхностные молекулы, которые передают сигналы апоптоза, инициируемые специфическими лигандами смерти, активируя каспазы смерти. Эти рецепторы относятся к суперсемейству генов рецепторов опухоле-некротического фактора.
Характерной особенностью этих рецепторов является наличие гомологичной цитоплазматической последовательности или домена смерти. CD95(Fas/APO-l) рецептор апоптоза был впервые охарактеризован на 5 Международном рабочем совещании по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека в 1993 году как клеточно-поверхностный гликопротеин с молекулярной массой от 40.000 до 50.000 Д (Robertson M.J. and Ritz J., 1993). Этот рецептор опосредует апоптоз, когда связывается с агонистическими антителами или собственным лигандом, который экспрессируется на клеточных мембранах или в растворимой форме. В настоящее время он находится в фокусе внимания ученых, так как играет важную роль в трех типах физиологического апоптоза, а именно: а) в периферической делеции активированных Т- лимфоцитов в конце иммунного ответа, б) в убийстве мишеней, таких как вирус - инфицированные или раковые клетки, цитотоксическими Т-клетками и натуральными киллерами и в) в убийстве клеток на иммунопривилегированном уровне, таком как глаз (Ashkenazi A. and Dixit V.M., 1998). Генетические дефекты в CD95 рецепторно-лигандной системе и фенотип CD95 - нокаутных мышей показали, что главной функцией CD95 системы является регуляция иммунного ответа и гомеостаза печени (Peter М.-Е. et.al, 1998). Сбои СБ95-системы могут быть вызваны генетическими изменениями рецептора или его лиганда, дифференциальной продукцией растворимой CD95(Fas/APO-l) молекулы, которая является продуктом альтернативного сплайсинга полноразмерной молекулы Fas и способна ингибировать Fas-опосредуемый апоптоз (Обушева М.Н. 1999), дефицитом в продукции CD95 лиганда, невозможностью активации каскада каспаз или гиперэкспрессией молекул, которые блокируют СБ95-опосредованный путь. Так, неограниченная элиминация клеток через CD95 систему может вызываться неограниченной экспрессией рецептора или лиганда на поверхностных мембранах. Это может быть связано с регуляторными дефектами в экспрессии генов или с продуктами, например, цитокинами, которые вызывают повышение экспрессии одной или нескольких молекул. Интерес к исследованию функции CD95 системы в онкологии недавен и связан в первую очередь с вовлеченностью CD95 рецептор-лигандной системы в лекарственно-индуцированный апоптоз при злокачественных новообразованиях. Исследования злокачественно трансформированных клеток при различных формах гемобластозов представляют уникальные возможности оценки нормальных дифференцировочных антигенов на различных стадиях дифференцировки. Поэтому исследование экспрессии антигена CD95(Fas/APO-l) является актуальной и перспективной задачей, как для оценки прогностической значимости, так и для изучения влияния этого антигена на дифференцировку клеток на различных этапах гемопоэза.
Цель работы
Целью работы является получение и характеристика моноклональных антител, направленных к CD95(Fas/APO-l) антигену, и оценка возможности применения данных антител для исследования иммунного статуса больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями, а также воспалительными заболеваниями.
Задачи исследования
Получить гибридому, продуцирующую моноклональные антитела, направленные к CD95(Fas/APO-l) антигену.
Охарактеризовать полученные моноклональные антитела.
Оценить экспрессию антигена CD95(Fas/APO-l) с помощью полученных моноклональных антител и её роль в исследовании иммунологического фенотипа больных с доброкачественными опухолями и хроническими воспалительными заболеваниями, при стандартной иммуносупрессии реципиентов с трансплантацией почки и сопутствующими осложнениями.
Оценить значение экспрессии антигена CD95(Fas/APO-l) с помощью полученных и охарактеризованных моноклональных антител ICO-160 при гемобластозах, а также его возможную прогностическую значимость.
Научная новизна
В Российском онкологическом научном центре им.Н.Н.Блохина РАМН получены и охарактеризованы с использованием зарубежных аналогов моноклональные антитела, направленные к антигену CD95(Fas/APO-l). Изучена зависимость экспрессии антигена CD95(Fas/APO-l) и дифференцировочных антигенов на различных этапах гемопоэза. С помощью полученных моноклональных антител орпеделена экспрессия CD95(Fas/APO-l) антигена на клетках больных с доброкачественными и воспалительными заболеваниями, для которых характерно активированное состояние иммунной системы. Изучена экспрессия антигена CD95(Fas/APO-l) на лимфоцитах периферической крови у больных после проведения хирургической операции по поводу трансплантации почки, в том числе у реципиентов со стабильной функцией трансплантата, с инфекционными осложнениями и у реципиентов с острым отторжением. Исследована экспрессия антигена CD95(Fas/APO-l) у больных хроническим лимфолейкозом, множественной миеломой, хроническим миелолейкозом, острым миелолейкозом, миелодиспластическим синдромом, острым лимфобластным лейкозом. Данные о выживаемости больных миелодиспластическим синдромом и острым лимфобластным лейкозом, клетки костного мозга которых экспрессируют антиген CD95(Fas/APO-l) показывают, что наличие CD95 имеет благоприятное прогностическое значение.
Научно-практическая значимость
Получены и охарактеризованы отечественные моноклональные антитела ICO-160, направленные против антигена CD95(Fas/APO-l). Убедительно показано значение экспрессии антигена в контексте с остальными параметрами иммунограммы при исследовании иммунологического фенотипа больных с доброкачественными и воспалительными заболеваниями, что отражает характер реагирования иммунной системы и является ценным диагностическим критерием. Оценка экспрессии антигена CD95(Fas/APO-l) при гемобластозах показала прогностическую значимость данного параметра при иммунофенотипировании клеток костного мозга больных острым лимфобластным лейкозом и миелодиспластическим синдромом.
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Апоптоз как форма гибели клеток
Биологам, особенно эмбриологам, давно известен феномен программированной клеточной гибели. Описание гибели клеток как физиологического явления появилось одновременно с возможностью гистологического окрашивания ткани, которое было выполнено в 1895 г. Флеммингом. Он описал распад отмирающих клеток эпителия яичников на частицы и назвал процесс быстрого исчезновения образовавшихся при распаде клеток фрагментов ядра "хроматолизом". Накопление сведений о гибели клеток, обусловленной физиологическими сигналами, передаваемыми с мембранных рецепторов в ядро, привело к пересмотру места клеточной гибели в нормальном существовании многоклеточных организмов. Результатом этого пересмотра явилось создание учения об апоптозе. Впервые термин "апоптоз" был введен Kerr, Wyllie и Currie (1972) для описания модели клеточной смерти, отличной от некроза. Апоптоз - это греческое слово, описывающее процесс опадания листьев с деревьев, когда клеточная смерть происходит без смерти всего организма. Морфологические изменения при апоптозе были описаны Wyllie А.Н. с соав. (1980). Апоптотические клетки сжимаются и сморщиваются, культивируемые клетки, растущие в монослое, открепляются от поверхности и обнаруживаются плавающими в культуральной среде. Хроматин конденсируется и обычно прилежит к ядерной оболочке и, по мере развития процесса, в ядерной мембране образуются инвагинации, ядра фрагментируются, каждый фрагмент содержит сильно конденсированный хроматин (Darzynkiewicz Z. et.al., 1994). Для апоптоза характерна потеря мембраной микроворсинок (Kontogeorgos G. et.al., 1995) и нормальной складчатости, образование выпуклостей, которые отшнуровываются и формируют апоптотические тельца, некоторые из которых содержат сильно конденсированные ядерные фрагменты (Wyllie A.H. et.al.,1980). Проявления некроза значительно отличаются от описанной картины. Они сводятся главным образом к сморщиванию органелл и дезинтеграции цитоплазмы. Хотя хроматин также конденсируется у ядерной мембраны, его компактные массы менее однородны и менее четко очерчены по краям (Новиков B.C., 1996). В отличие от некроза, когда одновременно гибнут массы соседствующих клеток, апоптоз развивается изолированно в единичных клетках. Если в случае некроза из клеток в среду поступает внутриклеточное содержимое, в частности лизосомы, что приводит к развитию и прогрессированию воспаления, то при апоптозе подобные явления отсутствуют (Ярилин А.А., 1996). И финальной морфологической особенностью апоптоза является фагоцитоз апоптотических телец клетками в ткани или макрофагами (Meyn R.E. et.al., 1994). В то время как морфологические особенности апоптоза были описаны более 20 лет назад, биохимические пути апоптоза выявлены только недавно. Отличительной биохимической чертой апоптоза является фрагментация ДНК в ядре клетки (Darzynkiewicz Z. et.al., 1994). Эта характерная фрагментация была исходно обнаружена Wyllie A.H. в 1980 году, но стала рассматриваться как отличительная особенность значительно позднее. Эта фрагментация обусловлена активацией Са2+ЛУ 2+-зависимой эндонуклеазы, которая или уже присутствует в клетке в неактивной форме или синтезируется в процессе ранних фаз апоптоза. Позднее были идентифицированы несколько эндонуклеаз (включая NUC18, ДНКза I и ДНКза II) как потенциальных медиаторов внутринуклеосомального расщепления (Thatte U. et.al., 1997). Фрагментация визуализируется при использовании электрофореза в агарозном геле в виде "лесенки" ДНК, которая показывает расщепление ДНК в результате формирования разрывов (в основном двунитевых) между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 нуклеотидных пар или кратным им по величине. К ключевым дистальным механизмам реализации апоптоза относят активацию семейства каспаз цистеиновых протеаз. Каспазы - от английского слова CASPASES (cysteine proteases which cleave proteins after an aspartic acid residue) - цистеиновые протеазы, которые расщепляют белки после остатка аспартатовой кислоты. Важность каспаз была продемонстрирована при изучении программированной клеточной смерти у нематоды Catnorhabditis elegans. Генетический анализ показал, что апоптоз в процессе развития С. elegans контролируется набором генов, которые были названы CED (cell death-defective), и включает Ced-3, Ced-4 и Ced-5 как основные регуляторы (Ellis R.E. et.al., 1991; Hengartner М.О. et.al., 1994). В дальнейшем было выявлено, что гены, названные Ced-З и Ced-4, необходимы для выполнения программы апоптоза во всех соматических клетках (Ellis R.E et al., 1991; Nicholson D.W. et.al., 1996). A Ced-9, также как и ему гомологичный протоонкоген Вс1-2, найденный у млекопитающих, препятствуют программированной клеточной гибели (Hengartner М.О. et. al.,1992). Молекулярное клонирование гена Ced-З показало, что он кодирует белок, который показал гомологичность с протеазой ICE (interleukin-ip converting enzyme) или каспазой- 1 (Yuan J. et. al, 1993; Thrnberry N.A. et.al., 1997, Simon H-U, 1996, Kumar S., 1992, Reed J.C., 1997, Свердлов Е.Д., 1998). И хотя каспаза-1 не играет очевидной роли в клеточной смерти, она стала первым идентифицированным членом большого семейства протеаз, члены которого имеют вполне определенные роли в процессах воспаления и апоптоза (Thornberry N.A. et.al., 1998). В норме каспазы присутствуют в клетках как неактивные проэнзимы, протеолитический процессинг специфических сайтов которых высвобождает их покоящуюся энзиматическую активность, затем происходит расщепление апоптотических субстратов, и запускается процесс клеточной деструкции. У млекопитающих идентифицировано 13 каспаз. Они могут активироваться с помощью двух механизмов. Первый заключается в раскрытии их до активированной молекулы. Этот "каспазный каскад" используется клетками для активации эффекторных каспаз, таких как каспаза-3, каспаза-6 и каспаза-7. Второй механизм связан с каспазой-8 (также называемой FLICE или МАСН), инициирующей каспазой, которая действует после рецептора смерти Fas/CD95 и играет центральную роль в С095-индуцированном апоптозе. После связывания с anti-CD95 антителами или лигандом, Fas рецептор агрегируется с образованием мультимолекулярного комплекса протеинов, который получил название гибель-индуцирующего сигнального комплекса или DISC.
Моноклональные антитела против Fas/APO-І антигена
Моноклональные антитела anti-Fas (клон СН-11) IgM класса получены Yonehara S. с соавт. в 1989г. В качестве иммуногена была использована клеточная линия человеческих диплоидных фибробластов FS-7. Одна гибридома продуцировала МКА, которые имели цитолитическое действие на различные человеческие клеточные линии. Авторы отмечают, что цитолитическая активность полученных МКА anti-Fas была неотличима от цитолитической активности опухолекротического фактора (TNF). И более того, цитолитическая активность как anti-Fas, так и TNF усиливалась, когда клетки-мишени обрабатывали гамма интерфероном, метаболическими ингибиторами (митомицин С, актиномицин D, циклогексимид) или когда клетки инкубировали с перечисленными факторами при высокой температуре (39С). Человеческие клетки, чувствительные к цитолитической активности TNF, были чувствительны и к anti-Fas МКА. Но, с другой стороны, как отмечают авторы, чувствительные клетки к МКА anti-Fas, не обязательно чувствительны к цитолитическому действию TNF. С помощью вестерн блоттинга на фракции плазматических мембран клеток линии U937 авторы показали, что anti-Fas-специфическая полоса соответствует мол. весу Fas-антигена в 200.000 Д, что отличает его от мол. веса рецептора TNF в 65,000 Д. Таким образом, был сделан вывод, что Fas-антиген не идентичен рецептору TNF, хотя действие anti-Fas сходно с TNF в цитолитической активности. Iton N. с соавт. (1991) поставили задачу показать, что цитолитическая активность anti-Fas антител связана с Fas антигеном. Anti-Fas MKA не реагировали с мышиными клетками. Поэтому чтобы показать что полипептид, кодируемый кДНК Fas-антигена может опосредовать цитолитическую активность anti-Fas MKA, рекомбинантная человеческая кДНК была трансфецирована в мышиные клетки Т клеточной лимфомы WR19L и мышиные фибробласты L929. Отобранные трансфецированные клоны WR19L инкубировали с различными концентрациями anti-Fas MKA при 37С в течение 24 часов. Авторы показали, что МКА действуют в дозовой зависимости, полностью убивая клетки при инкубации в течение 24 часов и концентрации МКА 1 мкг/мл. Индукция апоптоза MKA anti-Fas была показано с помощью электрофореза в агарозном геле, а оценка морфологических изменений показала, что поверхностные выпячивания мембраны клеток становились видны уже через 3,5 часа инкубации с 1 мкг/мл anti-Fas МКА, что наблюдалось и в других апоптотических системах (Wyllie А.Н. et.al.,1980). Далее коллективом авторов (Iton N. et.al. 1991) был уточнен мол. вес Fas-антигена. С помощью вестерн - блоттинга было определено, что МКА anti-Fas выявляют антиген с мол. массой 43,000 Д, что соответствовало вычисленной по аминокислотной последовательности молекулярной массе Fas антигена (Мг 36,000). Различие может быть объяснено присоединением Сахаров к двум N 35 гликозилированным сайтам, обнаруженным во внеклеточном домене Fas-антигена.
В дальнейшем, используя МКА anti-Fas СН-11 как МКА-агонисты для рецептора, Fadeel В. с соавт. (1995) показали, что эпитоп, к которому они направлены, является линейным доменом. В дальнейшем, используя данные МКА в своих исследованиях, Kobayashi N. с соавт. (1990) показали, что клетки, инфицированные человеческим вирусом иммунодефицита, более чувствительны к цитолитическому действию anti-Fas МКА, чем неинфицированные клетки. Nagata S. (1995) с помощью данных МКА исследовал, что экспрессия Fas антигена повышалась при действии гамма-интерферона в мышиной макрофагальной линии ВАМЗ и мышиных фибробластах L929 или человеческой аденокарциноме НТ-29, или в комбинации ITF-гамма и TNF- альфа в человеческих тонзиллярных В клетках. С помощью anti-Fas МКА СН-11 Effert Т. с соав. (1996) показали, что индукция апоптоза МКА СН-11 связана с истощением содержания клеточного глютатиона, которое связывают с образованием свободных радикалов и последующими ДНК нитевыми разрывами.
МКА АРО-1 получены Trauth B.C. с соавт. в 1989г. для характеристики клеточно-поверхностных молекул, вовлеченных в контролирование роста злокачественных лимфоцитов. В качестве иммуногена была использована человеческая В-лимфобластоидная клеточная линия SKW6.4. Было получено одно МКА, названное anti-APO-1, которое блокировало рост и индуцировало апоптоз в SKW6.4 клетках. Anti-Apo-І МКА относятся к IgG3 классу и связывают приблизительно 4x104 сайтов на поверхности SKW6.4 клеток. Они специфически
иммунопреципитируют антиген АРО-1 из SKW6.4 клеток, который при редуцирующих условиях был выявлен при электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле как полоса с мол. весом 52,000 Д. Действие МКА anti-APO-1 имеет характерные для апоптоза черты, а именно, вызывает конденсацию цитоплазмы, выпячивание мембраны и эндонуклеазо-индуцированную фрагментацию ДНК. Клеточная смерть, индуцированная anti-APO-І антителами, является комплемент независимой и запускается в бессывороточной среде или в культуральной среде с инактивированной сывороткой через 30 мин. Она отличается от комплемент зависимого лизиса морфологически и образованием ДНК - лестницы, независимостью от экзогенного Са . Авторы показали, что АРО-1 экспрессируется на различных человеческих В и Т клеточных линиях (В клеточные - SKW6.4, CESS, BJAB; Т-клеточные - Jurkat, Molt-4, CCRF-CEM) и не выявляется на обезьяньей MLA 144 или мышиной Т - клеточной линии EL4. Anti-APO-1 МКА индуцируют апоптоз в АРО-1-позитивных выше перечисленных клеточных линиях, при этом образование ДНК- лестницы регистрировалось в каждом случае. Исследование реактивности антигена CD95, оцениваемое с помощью МКА АРО-1, показало его экспрессию на свежевыделенных лейкозных клетках больных Т-ОЛЛ (Trauth Т. et.al.,1989). АРО-1 антиген не выявлен авторами на покоящихся В -лимфоцитах, однако экспрессия регистрируется на активированных В клетках. Также АРО-1 не определяется и на покоящихся Т-лимфоцитах, хотя активированные Т-лимфоциты экспрессируют АРО-1 и anti-APO-1 индуцируют апоптрз в этих клетках. Таким образом, авторы делают вывод, АРО-1 является видоспецифичным антигеном, экспрессируемым на активированных и злокачественных лимфоцитах. Авторами также была проведена оценка действия anti-APO-І МКА на опухолевый рост in vivo. Они выбрали Эпштейн-Барр-негативную Беркитт-подобную лимфому BJAB, хотя она была наименее чувствительна к обработке anti-Fas МКА, но образовывала большой опухолевый узел в необлученных nu/nu/ мышах. Через 5 недель после инъекции клеток BJAB мышам у них образовались опухоли диаметром от 1 до 2,5 см. Одна внутривенная инъекция АРО-1 в количестве 500 мкг/мышь приводила к регрессии опухоли у 10 из 11 мышей менее чем через 14 дней. Гистология срезов опухоли показала наличие морфологических изменений, характерных для апоптоза. Поэтому, с одной стороны, полученные результаты показали авторам явную потенциальную клиническую полезность применения МКА anti-APO-1 для регрессии опухоли на мышиной модели, но, с другой, понимая проблему в использовании мышиных МКА в терапии человека, приводящих к выработке человеческих анти-мышиных антител, в 1994 г. они опубликовали очень интересную работу о получении химерных мышь-человек anti-APO-І МКА (IgG3, каппа) (Coney L.R. et.al, 1994). Химерные МКА были получены в результате электропорации векторов, содержащих кодирующие последовательности вариабельных участков тяжелых и легких цепей anti-APO-І, в миеломные клетки SP2/0. В результате получены химерные МКА, имеющие константную область человеческого IgG3. Аффинность полученных МКА была сходна с мышиными anti-APO-І МКА. Химерные МКА показали такую же способность ингибировать рост SKW6.4 В-лимфобластоидной клеточной линии, как и мышиные anti-APO-І.
Получение моноклональных антител против CD95(Fas/APO-l) антигена, опосредующего апоптоз, и их характеристика
Мышей линии BALB/c дважды иммунизировали внутрибрюшинно с интервалом 4 недели мононуклеарными клетками здоровых доноров, активированными фитогемагглютинином (ФГА) фирмы Serva (Lectin from Phaseolus vulgaris, Type P) в количестве 10x106 клеток на мышь. Третий раз мышей иммунизировали внутривенно в хвостовую вену и проводили слияние на 5 день после иммунизации. Для роста полученных гибридомных клеток использовали селективную среду ГАТ (Flow Laboratories). Начиная с 7-го дня просматривали планшеты с помощью инвертированного микроскопа и отмечали в них рост колоний гибридомных клеток. Так как скорость деления клеток селезенки невелика, а скорость деления гибридомных клеток примерно такая же, как у клеток плазмоцитомы, поэтому быстрорастущие клоны гибридом становились различимы в виде плотных колоний. В результате двух слияний было получено 183 ГАТ-устойчивых гибридом. На 7-ой день после слияния, но не раньше чем через 3 дня после последней замены среды, проводили тестирование колоний как на ФГА-активированных мононуклеарных клетках здоровых доноров, так и на покоящихся лимфоцитах доноров. Отбирали гибридомные клоны, которые реагировали и с активированными, и с покоящимися мононуклеарами. Для проверки активности антител, отбирали по 100 мкл надосадочной жидкости и использовали ее при постановке непрямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции (РИФ). В результате первичного скрининга было отобрано 56 колоний, из которых выбрали по результатам проверки активности антител 4 колонии для клонирования методом лимитирующих разведений. Клонирование гибридом проводили на фидерном слое из тимоцитов и спленоцитов мыши линии BALB/c. По результатам первого клонирования в плашке N1 наблюдался рост в 20,8% лунок, в плашке N2 - в 36,4% лунок, в плашке N3 - в 21,6% лунок и в плашке N4 - в 20%) лунок. При первом клонировании продуцирующей антитела оказывается только небольшая часть клонов. В нашем случае для повторного клонирования была выбрана плашка N1, в которой была наибольшая частота продуцирующих клонов (20%). Из нее было расклонировано 3 гибридомных клона, результативность клонирования составила соответственно 15%, 21,6%) и 23,3%. Доля положительных клонов при повторном клонировании составила 77,7%, 92,3% и 85,7% соответственно. По результатам тестирования было отобрано по 2 гибридомы из каждого клонирования, клетки переведены в культуральные флаконы и заморожены. Для дальнейшей работы был отобран клон, стабильно продуцирующий МКА, которому присвоено название ICO-160. Для наработки МКА гибридомные клетки вводили мышам линии BALB/c и через 10-15 дней отбирали асцитную жидкость, из которой выделяли иммуноглобулины.
Определение класса исследуемых МКА проводили с помощью коммерческого набора "ISO Strip" фирмы "Boehringer Mannheim" (Indianapolis, IN). Было установлено, что МКА, продуцируемые клоном ICO-160, относятся к изотипу IgG2a.
Моноклональные антитела, направленные к CD95(Fas/APO-l) антигену, и предоставленные в рамках работы 6 Международного рабочего совещания по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека (Kobe, Japan) DX2 Lanier IgM C-64 антигена CD95. Оба МКА реагировали с лимфоцитами крови здоровых людей. В общей группе доноров без установления порогового уровня МКА ICO- 160 и МКА IPO-4 выявляли 25,1+1,4% (п=96) и 24,4+1,6% (п=63) соответственно, коэффициент корреляции г pearson=0,636, р=0,001. При установлении порогового значения для МКА IPO-4 более или равно 20% антиген позитивных клеток, процент выявляемых лимфоцитов составил 33,5+2,0 для МКА ICO-160 и 32,4+1,6 для МКА IPO-4, при этом сохранялась статистически значимая корреляционная зависимость (г pearson=0,395, р=0,013, корреляция достоверна при уровне р=0,05). На клетках больных хроническим лимфолейкозом МКА ICO-160 выявляли 41,5+3,8 процентов антиген позитивных клеток (N=14), МКА IPO-4 -42,1+10,0 процентов (N=9) при взятии порогового уровня более и равно 20% позитивных клеток. При исследовании экспрессии антигена CD95 с помощью коммерческих МКА АЬ-3 (CALBIOCHEM), мы выявили его экспрессию на 28,5+2,8 процентах лимфоцитов здоровых доноров (N=26). В этой группе доноров МКА ICO-160 выявляли 29,5+2,6 % лимфоцитов. Графическое изображение экспрессии антигена CD95 на лимфоцитах здоровых доноров, оцениваемое с помощью МКА ICO-160 и контрольных аналогов, отражено на рисунке 6. Рисунок 6. Графическое изображение экспрессии антигена CD95 с помощью тестируемых МКА ICO-160 по сравнению с контрольными аналогами на лимфоцитах здоровых доноров.
Проведенный статистический анализ по общей группе позволил выявить статистически значимую корреляционную связь между выявляемыми процентами лимфоцитов с помощью МКА Ab-З и ICO-160 ( 011=0,787, р=0,001). По аналогичной схеме установления порогового значения экспрессии антигена CD95 по коммерческим МКА Ab-З, выявляющим более и равно 20% антиген-положительных клеток, МКА Ab-З выявляли 34,2+2,4 процентов лимфоцитов, тестируемые МКА ICO-160 - 35,4+1,8 процентов лимфоцитов. Как и при анализе с МКА IPO-4 сохранялась статистически достоверная корреляционная связь (rpearson=0,469, р=0,037, корреляция достоверна при р=0,05). Графически значения средних и стандартное отклонение для пар МКА IPO-4 и ICO-160, МКА АЬ-3 и ICO-160 показаны в виде бокс-плота на рисунке 7, где средние значения для каждого МКА изображены в виде горизонтальной линии.
Изучение возможности применения МКА ICO-160 для проведения иммунологического фенотипирования в клинической практике
Известно, что приобретенный иммунный ответ целиком базируется на функционировании лимфоцитов. В первой фазе иммунного ответа происходит их активация, во второй - клональная пролиферация и в заключительной - превращение значительной части лимфоцитов в эффекторные клетки, а оставшейся - в клетки-памяти, обеспечивающие вторичный иммунный ответ. После выполнения эффекторных функций, таких как продукция антител В-клетками, секреция цитокинов активированными Т-клетками или убийство клеток-мишеней (хелперные и цитотоксические Т-клетки), лимфоциты должны быть удалены. Эта гибель активированных клеток необходима для подавления избыточного иммунного ответа. Это также относится к клеткам, которые распознают собственные антигены, но которые избежали селекции в тимусе.
Показано, что на активированных Т-, В- и NK-клетках повышается экспрессия антигена CD95 (Robertson M.J. and Ritz J., 1994, Mijawaki T. et.al., 1992, Schattner E. and Friedman S.M., 1996, Anel A. et.al.,1995, Robertson MJ. et.al., 1995), а также на Т-клетках у больных с хроническим воспалением (Yonehara S. and Nakamachi Y., 1996). В противоположность к Fas рецептору, экспрессия Fas лиганда является более ограниченной и нуждается в клеточной активации (Kiener P.A. et.al., 1997,Tanaka М. et.al., 1995, Suda Т. et.al., 1993, Hahne M. et.al., 1996), при этом на покоящихся лимфоцитах она очень низкая, но может быть индуцирована на Т- и В-клетках после активации. При этом на Т-лимфоцитах она обнаруживается на Т-хелперах 1 типа, что коррелирует со способностью Т-хелперов 1 подвергаться активационно-индуцированной гибели по сравнению с Т-хелперами 2 типа, которые способны погибать только в присутствии Т-хелперов 1 типа, экспрессирующих Fas-лиганд (Ramsdell F. et.al., 1994, Estaquier J. et.al., 1995). NK-клетки, как показали Montel A.H. с соавт. (1995), также способны использовать Fas-опосредованный литический путь. Поэтому нам было интересно проанализировать экспрессию Fas-антигена зрелыми лимфоцитами при их активации у больных с доброкачественными и хроническими воспалительными заболеваниями. Мы исследовали экспрессию антигена CD95(Fas/APO-l) на лимфоцитах периферической крови у 17 больных с диагнозом миома матки, у 10 больных с хроническим аднекситом и у 10 женщин с кистой яичника. Состояние иммунологического фенотипа у больных с миомой матки оценивали с помощью МКА, направленных к следующим дифференцировочным антигенам: CD3, CD4, CD8, CD16, CD24, CD25, CD71, CDllb, CD95. Результаты исследования экспрессии представлены в таблице 8.
Количество лимфоцитов у группы больных, экспрессирующих антиген CD95(Fas/APO-l), статистически значимо отличалось от числа лимфоцитов у группы здоровых доноров. При анализе субпопуляционной структуры у больных с миомой матки выявлены нарушения в виде повышения как количества Т-хелперов, так и более существенного увеличения цитотоксических Т-лимфоцитов, натуральных киллеров, нарастания CD24+ В-лимфоцитов, а также лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры - рецептор к ИЛ-2 (CD25) и трансферрину (CD71).
У данной группы больных также отмечено статистически значимое высокой степени достоверности повышение экспрессии антигена CDllb, молекулы адгезии, которая обеспечивает сродство к специализированному эндотеоию посткапиллярных венул. Зоны миграции лимфоцитов в ткань или венулы с высоким эндотелием появляются в зонах хронического воспаления, что связано с аккумуляцией лимфоцитов, обеспечивающих непрерывный надзор иммунокомпетентных клеток за внесосудистыми тканями (Маянский Д.Н., 1988). Сходная тенденция иммунных расстройств, проявляющаяся в снижении количества Т-клеток и стимуляция Т-супрессоров отмечена Карауловым А.В. (1999г.) у женщин с неспецифическими цервицитами. Проведенный корреляционный анализ у данной группы больных позволил выявить статистически значимые корреляционные связи экспрессии антигена CD95(Fas/APO-l), выявляемого с помощью МКА ICO-160, с экспрессией активационных антигенов CD25 и CD71 (г pearson =0,659, р=0,02 и г pearson =0,641, р=0,006 соответственно), а также с экспрессией антигена CD 16, являющегося маркером NK-клеток (г pearson =0,553, р=0,03) и экспрессией антигена CD24 В-лимфоцитов (г pearson =0,563, р=0,03). Приведенные данные позволяют отметить у группы больных, состояние иммунной системы которых можно охарактеризовать как активированное, изменение состава лимфоцитов, экспрессирующих антиген CD95. Если у здоровых доноров Fas антиген экспрессируется на 30-40% покоящихся Т-лимфоцитах периферической крови, небольшом количестве В-лимфоцитов и моноцитов и экспрессия его отсутствует на NK-клетках (Robertson MJ.et.al., 1995, Miyawaki T.et.al., 1992, Robertson M.J. and Ritz J., 1994, Kiener P.A. et.al., 1997), что также показано и в наших исследованиях с помощью двойного окрашивания (рисунок 18), то при активации при воспалительном заболевании экспрессия его определяется на активированных Т- и В-лимфоцитах и активированных NK-клетках, что также соответствует и приведенным ранее данным литературы.
Нами выявлена высокая экспрессия CD95 антигена лимфоцитах у больных с кистой яичника на 49,2+8,9% лимфоцитов периферической крови. У пациентов с хроническим аднекситом также отмечена повышенная экспрессия антигена CD95 на 43,9+7,5% лимфоцитов. У исследованных групп больных выявлена статистически значимая корреляция экспрессии антигена CD95 с активационными маркерами CD25 и CD71. Различия по сравнению с экспрессией антигена CD95 у здоровых доноров были статистически достоверны (р 0,05) во всех исследованных случаях.
Трансплантация почки является общепризнанным высокоэффективным методом замещения утраченной функции почки у больных в терминальной стадии хронической почечной недостаточности. Существенный вклад в развитие трансплантологии внесен разработкой и внедрением в клинику новых иммуносупрессивных препаратов, а супрессия иммунного ответа рассматривается как неотъемлемая часть ведения больных после пересадки органов. Практически новую эру ознаменовало появление циклоспорина А, малорастворимого метаболита грибов. В отличие от подавляющего большинства других иммуносупрессивных препаратов, циклоспорин А оказывает селективное воздействие на Т-лимфоциты. Он угнетает ранний клеточный ответ на антигены и регуляторные стимулы. Препарат селективно подавляет вызываемую интерлейкином-2 пролиферацию активированных Т-лимфоцитов, также препятствует образованию лимфокинов Т-хелперами. Циклоспорин А во всех дозах вызывает блокирование в GO/СІфазе клеточного цикла (Heavy Е. et.al.,1998). Циклоспорин А не ингибирует экспрессию высокоаффинных рецепторов для ИЛ-2 на активированных ФГА лимфоцитах периферической крови человека, но подавляет их отвечаемость на один из двух сигналов, определяющих ключевую роль в инициации пролиферации лимфоцитов - транзиторному раннему увеличению концентрации Са++ в цитоплазме (Дранник Г.Н. и др., 1994). При трансплантации почки циклоспорин А применяют в составе стандартной трехкомпонентной методики иммуносупрессии, включающей азатиоприн и преднизолон.
