Содержание к диссертации
Список принятых сокращений 3
Введение 4
1. Обзор литературы 8
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 8
Структурно-функциональные характеристики ДНК-иолимераз 11
Функциональные особенности и применение ДНК-полимераз 18
Компоненты ПЦР. Их свойства и влияние на условия и ход реакции 24
ПЦР в реальном времени 30
Иммунохимическое изучение Taq ДНК-полимеразы 34
Плазмонный резонанс 36
Метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии 41
2. Материалы и методы исследования 44
Получение и очистка рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы 44
Получение и выращивание клеток, продуцирующих моноклональные антитела к Taq полимеразе 45
Биохимическая очистка антител 46
2.4. Биотинилирование антител 46
2.5.БиотинилированиеТацРо1 47
2.6.Постановка иммуноферментного анализа для определения полимеразы,
конъюгированной с биотином 47
2.7 Выявление специфических антител к Taq ДНК-полимеразе методом
твердофазного ИФА 47
2.8.Взаимные блокировки антител 48
2,9.ЭлектрофорезвПААГе 48
2.10.Иммуноблот 49
2.11.Постановка ПЦР 50
2.12.0пределение аффинности мкАТ методом конкурентного ИФА 53
2.13.0пределение аффинности на приборе «IASys», основанном на принципе
плазмонного резонанса 53
2.14. Изучение термостабильности моноклональных антител 54
3, Результаты 55
Антитела, специфичные к Taq полимеразе 55
Взаимные блокировки мкАТ 56
Определение аффинности мкАТ с помощью конкурентного ИФА 57
Определение аффинности мкАТ на оптическом биосенсоре «IASys» 58
Исследование доменной специфичности моноклональных антител с помощью ИФА . 61
Исследование доменной специфичности мкАТ с помощью иммун облога 62
Изучение взаимодействия полученных антител с другими видами ДНК-полимераз методом ИФА и иммуноблота 63
Исследование влияния моноклональных антител на полимеразную активность Taq ДНК-полимеразы 64
Исследование характера влияния специфических антител на ход полимеразной цепной реакции 66
ЗЛО. Исследование термостабильности мкАТ методом дифференциальной
сканирующей микрокалориметрии 70
3.11. Исследование термостабильности комплекса Taq ДНК-полимеразы с
мкАТвИФА 71
4. Обсуждение 73
4Л. Антитела, специфичные к Taq ДНК-полимеразе 73
4.2. Эпитопное картирование Taq ДНК-полимеразы 73
4 3. Аффинность моноклональных антител к Taq ДНК-полимеразе 74
Определение доменной специфичности мкАт и сравнение их взаимодействия с ДНК-полимеразами и фрагментом TaqPol (KlenTaq) 77
Регуляция полимеразной активности фермента TaqPol 80
Термостабильность антител и комплекса антител с TaqPol 84
Выводы 85
Список используемой литературы 87
Список принятых сокращении
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ - дизоксинуклеозид трифосфат
ИФА - иммуноферментный анализ
Ка - константа аффинности
Касс - константа ассоциации
Кдисс - константа диссоциации
МкАТ - моноклональное антитело
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ТМБ - тетраметилбензидин
Ig - иммуноглобулин
PBS - фосфатно-солевой буфер
PBS/T - фосфатно-солевой буфер с 0,1 % Твин-20
PfUPol - ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Pyrococcus furiosus
TaqPol - ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Thermus aquaticus
Tm - температура плавления
TthPoI - ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Thermus thermophilus
CMV - цитомегаловирус
dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфат
дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфат
Введение к работе
Актуальность темы диссертации
Taq ДНК-полимераза (TaqPol) - фермент, который в настоящее время широко используется при ПЦР-диагностике различный заболеваний, генотипировании и во многих молекулярно-биологических приложениях [25]. Данный фермент проявляет одновременно два вида активности - полимеразиую и экзонуклеазную, является термостабильным и высокопроцессивным. Несмотря на все положительные свойства TaqPol, ведется поиск и создание новых форм этого белка, обладающих улучшенными потребительскими качествами. Для целенаправленной модификации фермента необходимо глубокое изучение структуры данного белка. Одним из инструментов исследования структуры белка являются моноклональные антитела. С помощью антител возможно не только изучение строения фермента, но и направленная регуляция его активности [5].
ДНК-полимераза проявляет заметную активность уже при комнатной
температуре и начинает работать сразу после приготовления ПЦР-смеси, еще до
нагревания. Это может приводить к образованию неспецифических продуктов реакции,
что существенно снижает чувствительность реакции. Для того, чтобы исключить этот
нежелательный эффект, применяют несколько способов, одним из которых является
использование специфических антител, блокирующих активность фермента до
температуры денатурации антител, что позволяет инициировать начало реакции только
после нагревания смеси. Применение антител в ПЦР дает ряд преимуществ, например,
по сравнению с широко используемым физическим разделением смеси парафиновой
прослойкой. Во-первых, применение антител уменьшает количество операций при
приготовлении ПЦР-смеси, сокращая время подготовки к анализу. Во-вторых,
поскольку температура плавления парафиновой прослойки ниже, чем температура
распада комплекса антител с TaqPol, то использование моноклональных антител
обеспечивает уменьшение количества неспецифических продуктов реакции, увеличивая специфичность анализа.
В связи с этим представляется актуальным изучение структуры и свойств фермента, а также регуляции его активности, с помощью моноклональных антител.
Цель работы
Целью данной работы являлось получение моноклональных антител, реагирующих с Taq ДНК-полимеразой, способных регулировать активность фермента и перспективных для использования в диагностических ПЦР тест-системах для создания условий «горячего старта».
Задачи исследования
1. Создать гибридомные линии, продуцирующие моноклональные антитела к
Taq ДНК-полимеразе.
Определить эпитопную структуру Taq ДНК-полимеразы и доменную специфичность антител.
Изучить перекрестную реактивность полученных антител с другими термостабильными ДНК-полимеразами.
Определить константы аффинности антител.
Изучить влияние моноклональных антител на функциональную активность Taq ДНК-полимеразы.
Научная новизна
Впервые проведено систематическое исследование эпитопной и доменной структуры Taq ДНК-полимеразы.
Впервые проведено исследование влияния антител на ферментативную активность ДНК-полимеразы при помощи ПЦР в режиме «реального времени» с использованием праймеров с заменами нуклеотидов.
Впервые найдено антитело, увеличивающее сродство Taq ДНК-полимеразы к дуплексам неспецифических праймеров с ДНК-матрицей.
Теоретическая и практическая значимость работы
Настоящая работа выполнена в рамках программы фундаментальных исследований. Научная значимость настоящего исследования заключается в получении новых сведений об эпитопной и доменной структуре Taq ДНК-полимеразы. Полученные данные позволяют более целенаправленно вести поиск новых модификаций Taq ДНК-полимеразы, обладающих повышенными реакционными свойствами. Созданные антитела могут найти практическое применение в качестве компонента новых более совершенных ПЦР тест-систем.
Публикации
Семенихина Н.Н., Храмцов А.В., Филатов А.В. Изучение антигенной структуры белка р24 ВИЧ-1. Аллергология и иммунология, 2004, т. 5, № I, с. 110.
Семенихина Н.Н., Храмцов А.В., Абрамов Д.Д., Павлова О.Г., Трофимов Д.Ю. и Филатов А.В. Получение антител к Taq ДНК-полимеразе. Материалы третьего съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва, 2005, с. 20.
Семенихина Н.Н., Абрамов ДД Изучение структурно-функциональных характеристик Taq ДНК-полимеразы Материалы 10-ой пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2006, с. 47.
4. Семенихина НН., Павлова О.Г., Храмцов А.В., Савилова A.M. и Филатов А.В. Получение гибридом, секретирующих специфические антитела к Taq ДНК-полимеразе, и изучение структурной характеристики фермента. Физиология и патология иммунной системы, 2006, т. 10, № 5, с. 3-Ю.
