Введение к работе
Актуальность проблемы. Тиреоглобулин (ТГ) - йодированный гликопротеин с молекулярной массой 660 кДа, синтезируемый клетками фолликулярного эпителия щитовидной железы (Dunn, 1970; Vali et al., 2000). Он является предшественником тиреоидных гормонов, играющих ведущую роль в регуляции развития, дифференцировки и метаболизма тканей и органов позвоночных животных (Dumont et al., 2003).
Молекулы ТГ человека и ряда млекопитающих представляют собой димеры, построенные из идентичных полипептидных цепей длиной 2760-2770 аминокислотных остатков (Malthiery, Lissitzky, 1987). В составе цепей обнаружены повторяющиеся последовательности, образующие домены трех типов. Гомология аминокислотных последовательностей ТГ животных разных видов достигает 70-80% (Caturegli et al., 1997; Ramos et al., 2002). Следствием структурного подобия является перекрестное взаимодействие антител, полученных против ТГ одного из видов животных, с ТГ других видов (Stylos, Rose, 1968; Bresler et al., 1990). Определенным участкам первичной структуры ТГ свойственна также высокая степень гомологии с другими известными белками, в том числе ацетилхолинэстеразой (АХЭ) (Takagi et al., 1991).
После синтеза полипептидных цепей ТГ молекулы претерпевают множественные посттрансляционные модификации (присоединение углеводных, сульфатных, фосфатных групп и атомов йода) и транслокации (экспорт из тиреоцитов, включение в состав коллоида, импорт в тиреоциты и трансцитоз), взаимодействуя при этом с рядом рецепторов, транспортных белков и ферментов. Участки молекулы ТГ, обеспечивающие эти взаимодействия, до сих пор не идентифицированы.
Одним из подходов к выявлению функциональных сайтов ТГ является изучение его антигенных детерминант (эпитопов) с помощью моноклональных антител (МКАТ). Главное преимущество МКАТ состоит в том, что они распознают отдельные эпитопы (участки поверхности) антигенов. Эти участки могут находиться вблизи функциональных сайтов молекулы или топографически совпадать с ними, что позволяет исследовать связи между структурой и функциями молекул и проводить детальное картирование их антигенных детерминант (Абелев, Карамова, 1996).
Панели МКАТ против ТГ человека и животных получены в нескольких лабораториях (Zanetti et al., 1983; Kodama et al., 1984; Kondo, Kondo, 1984; Sikorska et al., 1986; Chan et al., 1987;.De Baets et al., 1987; Heilig et al., 1987; Ruf et al., 1987; Bresler et al., 1990; Saboori et al., 1994; 1998; Erregragui et al., 1997). Число антител, включенных в такие панели, обычно не превышает двадцати. Все эти МКАТ созданы на основе иммунных лимфоцитов мышей линии BALB/c (H-2d), следовательно, спектр распознаваемых ими эпитопов ТГ ограничен репертуаром иммунного ответа мышей указанной линии.
В лаборатории гибридомной технологии ЦНИРРИ создана уникальная панель из 52 МКАТ против ТГ человека. Основное отличие этой панели от описанных ранее состоит в том, что донорами иммунных лимфоцитов при получении гибридом служили мыши линии SJL/J, отличающиеся от BALB/c главным локусом гистосовместимости (H-2s) и репертуаром иммунного ответа. Очевидно, полученная совокупность МКАТ распознает иной спектр антигенных детерминант ТГ и требует специального изучения.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении свойств МКАТ и исследовании природы распознаваемых ими антигенных детерминант ТГ у представителей разных таксонов позвоночных животных.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Охарактеризовать полученные МКАТ по антиген-связывающей
активности и изотипической принадлежности.
2. Изучить перекрестную реактивность МКАТ с ТГ животных разных
видов и установить, какие из эпитопов ТГ человека являются
видоспецифическими, а какие - эволюционно консервативными.
-
Исследовать взаимодействие МКАТ с тиреодными гормонами и АХЭ.
-
Исследовать эпитопную специфичность МКАТ.
-
Классифицировать распознаваемые МКАТ антигенные детерминанты ТГ человека по их зависимости от конформации молекулы.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Панель из 52 МКАТ позволяет выявить на молекуле ТГ человека 41 эпитоп, 15 из которых являются линейными, остальные 26 - конформационно зависимыми.
-
Распознаваемые МКАТ эпитопы не относятся к числу гормоногенных.
-
На молекуле ТГ человека, наряду с видоспецифическими эпитопами, выявлены эволюционно консервативные антигенные детерминанты, представленные также на ТГ млекопитающих, птиц и амфибий.
-
На молекуле ТГ человека выявлены эпитопы, общие с АХЭ, что указывает на их локализацию в С-концевой части молекулы ТГ.
-
Видоспецифические эпитопы ТГ человека являются конформационно зависимыми. Все линейные эпитопы молекулы ТГ человека относятся к числу эволюционно консервативных.
Научная новизна работы. Впервые установлено, что на молекуле ТГ человека присутствуют более 40 антигенных детерминант, выявляемых МКАТ.
Показано, что структура и состав антигенных детерминант ТГ может различаться у близкородственных видов млекопитающих и быть сходной у животных, относящихся к разным таксономическим группам.
Впервые с помощью МКАТ исследованы антигенные детерминанты молекул ТГ птиц и амфибий; показано, что состав эпитопов ТГ амфибий существенно отличается от такового у млекопитающих.
Впервые для анализа эпитопной специфичности МКАТ против ТГ применен сравнительно-биологический подход, основанный на сопоставлении групп взаимного ингибирования МКАТ и спектров эпитопов ТГ животных разных видов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выявление линейных эпитопов молекулы ТГ позволяет в дальнейшем идентифицировать образующие их последовательности аминокислотных остатков и, таким образом, картировать ряд антигенных детерминант ТГ человека и животных.
Данные о топографической удаленности эпитопов ТГ являются основанием для отбора МКАТ при конструировании двухдетерминантных систем детекции и количественного определения ТГ человека и животных.
Найдены оптимальные условия для выявления ТГ на препаратах ткани щитовидной железы иммуногистохимическими методами.
МКАТ, распознающие эпитопы ТГ животных, могут использоваться в экспериментальных и сравнительно-биологических исследованиях развития, структуры и функции щитовидной железы млекопитающих, птиц и амфибий.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на XII
Международном Совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург,
2001), Пироговской студенческой научной конференции-2002 (Москва, 2002),
VI, VII, IX и X Всероссийских научных форумах с международным участием
"Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2002, 2003, 2005,
2006), Международной научно-практической школе-конференции "Цитокины.
Воспаление. Иммунитет" (Санкт-Петербург, 2002), 6-ой (Пущино, 2002) и 7-ой
(Москва, 2005) Школах Джона Хамфри по иммунологии, 5-ом Конгрессе
"Современные проблемы аллергологии, иммунологии и
иммунофармакологии" (Москва, 2002), научно-практической конференции "Современные технологии в клинической медицине" (Санкт-Петербург, 2003), 1-ом съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), III Съезде иммунологов России (Екатеринбург, 2004) и Школе DAAD "Current Trends in Comparative Immunology. The Interface Between Immunology and Medicine" (Санкт-Петербург, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работы состоит из введения; обзора литературы; экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования; обсуждения; выводов; списка литературы, состоящего из 303 источников; приложения. Работа изложена на 142 страницах и содержит 23 рисунка и 19 таблиц.
