Изучение свойств моноклональных бифункциональных антител в а-эндорфину и пероксидазе хрена Дергунова, Наталья Николаевна

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Наряду с обычными моноклональ-ными антителами (МКА) гибридомная технология позволяет получать биспецифические антитела (БИЛТ), несущие места связывания двух различных антигенов. Для получения клонов-продуцентов БИЛТ сливают две гибридомы (или, в другом варианте, гибридому и иммунные лимфоциты), секретирующие различные МКА. В образующихся гибридных гиб-ридомах (так называемых, квадромах или триомах) происходит рекомбинация легких (L, light) и тяжелых (II, heavy) цепей родительских антител, в результате чего образуется несколько видов антител, включая БИАТ (рис. 1). Несмотря на кажущуюся простоту описанного механизма, многие аспекты процесса образования квадромных антител остаются неизученными. С теоретической и практической точек зрения представляется важным выяснение вопроса о том, какой тип ассоциации L и Н цепей превалирует в гибридных гибридомах при сборке молекул антител - случайная рекомбинация, или имеет место предпочтительное связывание гомологичных цепей (то есть цепей, происходящих от одного родительского МКА). В теоретическом плане этот вопрос тесно связан с проблемой разнообразия антител. Существует гипотеза, что предпочтительная ассоциация может быть следствием процессов, направленных на отбор высокоаффинных H-L пар во время созревания В-клеток- С практической точки зрения важно то, что способ ассоциации цепей должен влиять на распределение квадромных антител. В частности, предпочтительная ассоциация гомологичных легких и тяжелых цепей повышает выход БИАТ, так как гетерологичные H-L пары, как правило, неактивны в отношении связывания с антигенами. Вместе с тем, изучение качественного и количественного состава иммуноглобулинов, секретируемых гибридными гибридомами, осложняется недостаточной разработкой методов анализа квадромных антител (смеси близких по молекулярному весу и физико-

химическим свойствам молекул). В методическом плане такой анализ оказывается достаточно сложной задачей. В особенности это относится к количественным аспектам популяций квадромных антител, которые практически не анализировались

С вопросом о взаимодействии цепей тесно связан и вопрос об анти-генсвязывающих свойствах наиболее интересного (с точки зрения биотехнологии) продукта секреции гибридных гибридом - БИАТ. В какой мере гибридная молекула сохраняет аффинность родительских антител? Сведения об этом весьма ограничены: подробное исследование антиген-связьгвающих свойств БИЛТ, полученных с помощью гибридизации клеток, было проведено в единичных работах. Таким образом, актуальным является разработка методов анализа антител, секретируемых гибридными гибридомами, изучение их антигенсвязывающих свойств и механизмов образования.

В настоящей работе предпринята попытка исследовать некоторые из этих вопросов, используя в качестве модели полученную в лаборатории нейроиммунологии НЦПЗ РАМН гибридную гибридому (квадрому), специфичную к а-эндорфину (ЭНД) и пероксидазе хрена (ПХ).

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы было изучение взаимодействия БИАТ с антигенами, а также разработка экспериментальных подходов, позволяющих проводить количественный и качественный анализ продуктов секреции гибридных гибридом и расшифровывать способ ассоциации L и Н цепей в гибридных клетках.

В задачи работы входило:

1. Разработать теоретические модели рекомбинации легких и тяжелых цепей в гибридных гибридомах, позволяющие предсказывать характер распределения антител в зависимости от способа ассоциации Н и L цепей.

1. С помощью аффинной хроматографии и радиоиммунологического анализа провести количественный анализ продуктов секреции трех клопов квадромы, специфичной к ЭНД и ПХ.

2. Проанализировать аффинноочищенные фракции квадромных антител в отношении состава легких и тяжелых цепей с помощью двумерного электрофореза.

3. Путем сопоставления экспериментальных и теоретических распределений антител и результатов электрофоретического анализа H-L состава расшифровать способ ассоциации легких и тяжелых цепей в квадромных клонах.

4. Изучить взаимодействие БИЛТ с антигенами, в том числе в отношении наличия или отсутствия кооперативного эффекта. Сравнить аффинность БИАТ и родительских МКА. Изучить возможность использования БИАТ в иммуноблоттинге и иммуногистохимии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. В результате проведенного исследования впервые были детально проанализированы количественные аспекты популяций квадромных антител. Также впервые проведен анализ H-L состава квадромных антител с помощью двумерного электрофореза в по-лиакриламидном геле. Использование качественного и количественного методов анализа антител позволило убедительно доказать наличие гомологичного предпочтения в одной из H-L пар и случайную рекомбинацию - в другой. Разработанные в настоящей работе оригинальные экспериментальные подходы и теоретические модели расширяют возможности анализа квадромных антител и механизмов, управляющих образованием этих антител в квадромных клетках. Кроме того, анализ аффинности БИЛТ, образованных квадромой, показал, что эти молекулы в полной мере сохранили антигенсвязывающие свойства родительских антител. Мы показали также отсутствие кооперативного эффекта при связывании

БИАТ с антигенами. Полученные результаты могут представлять интерес для возможного использования этого нового класса биомолекул.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы были доложены на Первой Международной зимней школе по нейрохимии "Новые тенденции в исследовании метаболизма мозга", Санкт-Петербург (1995).

По теме диссертации опубликовано семь печатных работ: тезисы и шесть статей.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 100 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы (100 источников). Диссертация иллюстрирована 8 фотографиями, 9 таблицами, 8 рисунками.

2-ое родительское антитело

Рис.1. Антитела квадромы. Легкая (L₍) и тяжелая (Hj) цепи антител к антигену 1 (АГ1), леїкая (L₂) и тяжелая (Н₂) цепи антитела к антигену 2 (АГ2). (А) - случайная рекомбинация легких и тяжелых цепей IgG; (Б) -предпочтительная рекомбинация по обеим цепям; (В) - предпочтительная рекомбинация по одной паре цепей.

1111 1-ое родительское I |

антитело

БИАТ

l||l i||i i|

Hi анти-АП антитела

(А) L,

'L,

анти-АГ2 антитела Н₂

_II^і _'!1^[ _'І!¹

функционально неактивные антитела

(Б)

_'I

анти-ЛГІ AT

БИАТ

анти-АГ2 AT

m '|!^!

БИЛТ

_'II^і _'II^і

анти-ЛГ2 AT

анти-АП AT

_'II^і

неактивные AT

Похожие диссертации на Изучение свойств моноклональных бифункциональных антител в а-эндорфину и пероксидазе хрена

Изучение некоторых свойств антител к общей антигенной детерминанте всех бактерий и их роли в норме и при патологииТельнюк Яна Ивановна

Изучение иммунохимических свойств антигенов bordetella pertussis как компонентов бесклеточной вакцины с помощью моноклональных антителБуркин, Максим Алексеевич

Изучение свойств естественного ингибирующего фактора и путей коррекции иммунопатологии, обусловленной его гиперфункциейРодосская Нонна Кирилловна

Изучение биологических свойств нового препарата антигипоксического действия "Конфумин" в экспериментеГерасимова Мария Леонидовна

Сравнительное изучение иммунорегуляторных свойств альфа2-макроглибулинов человека и мышиЛыкова, Ольга Федоровна

Изучение иммунобиологических свойств секретируемых белоксодержащих антигенов Klebsiella pneumoniaeВоюшин Константин Евгеньевич

Изучение иммунотропных свойств хиральных кватернатов 3-оксихинуклидинаАнисимова Наталья Юрьевна

"Изучение биологических свойств нового препарата антигипоксического действия ""Конфумин"" в эксперименте" [Электронный ресурс]Герасимова Мария Леонидовна

Изучение функциональных свойств макрофагов человека и влияние на них компонентов клеточной стенки бактерийИльинская Анна Николаевна

Исследование процессов выделения поверхностного антигена вируса гепатита В из ... продуцента дрожжей и изучение его иммунологических свойствКурбатова, Ирина Юрьевна