Содержание к диссертации
Введение 7
ЧАСТЫ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ АНТИГЕННЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ 12
ХАРАКТЕРИСТИКИ Klebsiella pneumoniae
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНЫХ 29
АНТИГЕНОВ Klebsiella pneumoniae И ИЗУЧЕНИЕ ИХ
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ГЛАВА 3. РОЛЬ Klebsiella pneumoniae ПРИ АУТОИММУННЫХ 40
ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЧЕЛОВЕКА
ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 50
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 50
Штаммы микроорганизмов 50
Питательные среды 50
Лабораторные животные 51
Определение вирулентности штаммов К. pneumoniae 51
Получение белоксодержащих фракций из культуральной 52 надосадочной жидкости штаммов K.pneumoniae
Определение протеазной активности белоксодерщих 55 фракций, полученных из культуральной надосадочной жидкости
Определение молекулярной массы белоксодержащих 55 соединений, полученных из культуральной надосадочной жидкости ..
Проточная цитофлуориметрия 56
1.9. Методы химического анализа 57
1.10.ЛАЛ-тест 57
1.11 .Иммуноблоттинг 59
Получение препаратов для иммунизации животных 60
Протеолиз белоксодержащей фракции 60
Определение протективной активности секретируемых 60 белоксодержащих фракций
Определение антител к секретируемым белоксодержащим 61 фракциям K.pneumoniae в ИФА
Получение гипериммунных сывороток 62
Определение превентивной активности сывороток 62
Определение уровня цитокинов в сыворотке крови 63 иммунизированных мышей
Определение уровня антител к органоспецифическим и 63 органонеспецифическим антигенам человека в сыворотке крови мышей, иммуниированных препаратом оргнов и тканей человека К. pneumoniae К2 30-50 кДа
Определение IgG антител к препарату К. pneumoniae К2 63 30-50 к Да в сыворотках крови пациентов с анкилозирующим спондилитом
Противоопухолевая активность 64
Статистическая обработка данных 65
ГЛАВА 2. ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНОИ 66
НАДОСАДОЧНОИ ЖИДКОСТИ ШТАММОВ К.рпеитопіае И ИЗУЧЕНИЕ ЕЕ ПРОТЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
Выбор штаммов К.рпеитопіае 66
Культивирование штаммов К.рпеитопіае и получение 67 культуральной надосадочной жидкости
Изучение протеолитической активности культуральной 72 надосадочной жидкости штаммов К.рпеитопіае различных по вирулентности
ГЛАВА 3. ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ 77
БЕЛОКСОДЕРЖАЩИХ КЛЕБСИЕЛЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ
ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТА К. 86 pneumoniae К2 30-50 кДа, ПОЛУЧЕННОГОГО ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ
Химический состав препарата К. pneumoniae К2 30-50 кДа, 86 полученного из культуральной надосадочной жидкости
Иммунохимическая характеристика препарата 92 К.рпеитопіае К2 30-50 к Да, полученного из культуральной надосадочной жидкости
Острая токсичность препарата К pneumoniae К2 30-50 кДа, 96 полученного из культуральной надосадочной жидкости
ГЛАВА 5. РОЛЬ АНТИТЕЛОЗАВИСИМЫХ 98
ЭФФЕКТОРНЫХ МЕХАНИЗМОВ В ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА К.рпеитопіае К2 30-50 кДа, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ
Роль антител к препарату К.рпеитопіае К2 30-50 кДа в 98 защите от экспериментальной клебсиеллезной инфекции
Исследование сывороток больных болезнью Бехтерева 102 (анкилозирующий спондилит)
ГЛАВА 6. СПОСОБНОСТЬ ПРЕПАРАТА К.рпеитопіае К2 107 30-50 КДА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ, СТИМУЛИРОВАТЬ НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОРГАНИЗМА
Стимуляция неспецифической резистентности препаратом 107 К.рпеитопіае К2 30-50 КДА на моделях бактериальной инфекции.
Противоопухолевая активность препарата К.рпеитопіае К2 109 30-50 кДа, полученного из культуральной надосадочной жидкости
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 115
ВЫВОДЫ 124
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 126
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из наиболее важных с медицинской точки зрения представителей рода Klebsiella является Klebsiella pneumoniae sp. pneumoniae - широко распространенный возбудитель инфекционных процессов различной локализации. Есть данные о возможной роли К. pneumoniae в манифестации и обострениях болезни Бехтерева у HLA-B27-позитивных лиц [47, 66, 67].
На протяжении последних десятилетий К. pneumoniae занимает одно из первых мест в структуре внутрибольничных инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами [13, 48, 92, 157]. К группе высокого риска инфицирования относятся пациенты с иммунодефицитом, новорожденные, лица пожилого и старческого возраста [139, 166]. Летальность от клебсиеллезного сепсиса и пневмонии составляет 20-50% [8, 139].
Недостаточная эффективность традиционной терапии, обусловленная растущей полирезистентностью штаммов к антибиотикам, определяет необходимость разработки иммунологических препаратов для активной иммунизации контингента групп риска, а также для иммунотерапии тяжелых случаев клебсиеллезов при использовании гипериммунной донорской плазмы, клебсиллезного иммуноглобулина или других средств пассивной иммунотерапии [40].
В настоящее время в клинической практике применяют только бактериальные поликомпонентные вакцины для активной иммунотерапии пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями, вызываемыми условно-патогенными микроорганизмами, содержащие в своем составе антигены К. pneumoniae (рибомунил, бронхомунал, респивакс, иммуновак-ВП-4 и др.) [9, 14, 20, 39, 124 и др.]. Эти препараты предназначены, прежде всего, для коррекции вторичного иммунодефицита.
Многолетние исследования по разработке противоклебсиеллезной вакцины не привели к созданию эффективного препарата, используемого в практике здравоохранения. В качестве наиболее перспективных антигенов для получения вакцин рассматривали капсульный полисахарид или липополисахарид (ЛПС) К. pneumoniae [35, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59]. Роль белоксодержащих антигенов К. pneumoniae изучена недостаточно. В последнее время появились сообщения об иммуногенной активности белков наружной мембраны К. pneumoniae, характеризующихся высоким уровнем гомологии у представителей семейства Enterobacteriaceae [94].
Секретируемые белоксодержащие компоненты К. pneumoniae, представленные ферментами (протеазы, гликозидазы и др.), токсинами, гемолизинами, белками теплового шока и др., с целью получения протективных антигенов, практически не изучались. Высокая консервативность аминокислотной последовательности этих соединений у разных штаммов К. pneumoniae открывает новую область их примненения для получения антигенов с внутри- и, возможно, межвидовой перекрестной протективной активностью.
Цель исследования. Получение и характеристика иммунобиологических свойств секретируемых белоксодержащих антигенов К. pneumoniae.
Задачи исследования:
Получить из культуральной надосадочной жидкости штаммов К. pneumoniae различной степени вирулентности белоксодержащие соединения и определить протеазную активность полученных фракций.
Изучить протективную активность секретируемых белоксодержащих фракций К. pneumoniae при заражении гомологичным и гетерологичными К-типами К. pneumoniae.
3. Дать химическую и иммунохимическую характеристику препаратов,
полученных на основе секретируемых белоксодержащих фракций К.
pneumoniae.
Исследовать иммунный ответ у животных при иммунизации секретируемыми белоксодержащими фракциями К. pneumoniae.
Изучить действие секретируемых белоксодержащих фракций на формирование неспецифической резистентности к инфекции и их противоопухолевую активность в экспериментах на животных.
6. Определить диагностическую значимость секретируемых
белоксодержащих антигенов в ИФА при анализе здоровых и больных
болезнью Бехтерева.
Научная новизна. Впервые при культивировании К. pneumoniae на полусинтетической среде получены протективные секретируемые белоксодержащие фракции, определены их иммунобиологические свойства и дана химическая и иммунохимическая характеристика.
Установлено, что штаммы K.pneumoniae К2, К16 и нетипируемого по К-антигену штамма №204 продуцируют только один вид протеазы с молекулярной массой 21 кДа, обладающую эластазоподобной активностью, которая не зависит от степени вирулентности штамма и возрастает при прибавлении в среду культивирования субстрата протеазы - гликопротеина. Обнаружено, что фракция, содержащая данный фермент не обладает протективной активностью. Показано, что при внесении в среду культивирования гликопротеина происходит повышение продукции штаммами K.pneumoniae белоксодержащих соединений в области 50 к Да и углеводсодержащих соединений в областях 25, 50, 60 и 70 кДа.
Установлено, что внутривидовой протективной активностью обладает фракция 30-50 кДа, содержащая белок, углеводы и примесь ЛПС. Основные белковые компоненты фракции имеют молекулярную массу 35 и 40 к Да и
являются общими для всех исследованных штаммов (К2, К16, 204). Протеолитическое разрушение белка приводит к утрате защитных свойств препарата. Методами проточной цитофлюориметрии и ИФА показано, что белоксодержащие фракции относятся к секретируемым антигенам, а не являются продуктами лизиса микробных клеток.
Показано, что препарат К.рпеитопіае К2, полученный на основе фракции с молекулярной массой 30-50 кДа приводит к выработке специфических антител IgG класса, повышает уровень цитокинов IL-6, TNF-а, IL-10, IL-12 в сыворотке крови мышей, но не является активным стимулятором неспецифической резистености организма при испытанных дозах и схемах введения.
Выявлено, что сыворотки крови пациентов с болезнью Бехтерева содержат антитела к белоксодержащей фракции 30-50 кДа, иммунизация которой не приводит к образованию антител к органонеспецифическим и органоспецифическим антигенам человека.
Практическая значимость. Секретируемая белоксодержащая фракция К. pneumoniae К2 30-50 кДа может быть использована как основа для разработки противоклебсиеллезной вакцины с внутривидовой перекрестной протективной активностью для активной иммунизации пациентов групп риска и получения гипериммунной плазмы для терапии тяжелых случаев клебсиеллезной инфекции, а также для разработки диагностических тест-систем.
При получении препаратов на основе секретируемых белоксодержащих фракций микроорганизмов, культивируемых на синтетических или полусинтетических средах, можно использовать гликопротеин для определения ориентировочного диапазона локализации протективных антигенов, продуцируемых микробной клеткой в среду культивирования.
Расшифровка аминокислотной последовательности секретируемых протективных белков К. pneumoniae может явиться предпосылкой для получения генно-инженерных вакцин и иммуногенов.
Использование указанных подходов по получению протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих фракций К. pneumoniae может быть применено к получению протективных антигенов из других микроорганизмов.
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
