Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время злокачественным новообразованиям! яшадлежит второе место в структуре заболеваний, приводящих к летальному исходу, ерспективы излечения данной патологаи связаны с разработкой эффективных методов інней диагностики, иммунопрофилактики и терапии. В связи с этим, весьма актуальным яяется изучение специфических белков опухолевых клеток. С этой точки зрения ибольший интерес вызывают универсальные опухолеспецифические маркеры, которые спрессируются на большей части типов опухолей, но отсутствуют на нормальных клетках, дним из таких маркеров может оказаться рецептор онкофетального белка альфа-яшротеина (РеАФП). АФП является основным белком сыворотки крови плода, главная декция которого заключается в транспорте жирных кислот внутрь пролиферирующей етки. Известно несколько различных белков, способных связывать АФП. РеАФП — это 1>П-связывающий белок, встроенный в поверхностную мембрану клеток. Впервые іедположение о существовании специфического РеАФП было сделано R. Мого в 1981 году я объяснения поглощения АФП растущими клетками (Мого R. et al., 1981). К настоящему емени известно, что: 1) РеАФП представляет собой трансмембранный гликопротеин (Suzuki et al., 1992; Mora R. et al., 1993; Severin S.E., et al. 1994; Kanevsky V.Yu. et al., 1997); 2) АФП обеспечивает перенос АФП внутрь клетки по механизму рецептор-опосредованного доцитоза (MJ.Villacampa et al., 1984); 3) В сыворотке крови больных раком достоверно івьппен уровень антител к РеАФП по сравнению со здоровыми людьми (Астахов Д.В. и др., 99). Исходя из того, что различные культивируемые in vitro опухолевые клетки и [бриональные клетки, в отличие от нормальных, способны накапливать АФП (Uriel J. et al., 79), было сформулировано представление о РеАФП как об универсальном онкофетальном яке и опухолевом маркере (Uriel J. et al., 1984; Мого R. et al., 1984). РеАФП был обнаружен мембране некоторых культивируемых in vitro опухолевых клеток, моноцитах и имулированных in vitro лимфоцитах периферической крови человека, причем уровень его спрессии на опухолевых клетках был выше, чем на моноцитах и стимулированных мфоцитах (Mizejewski G.J., 2001). Данные об уровне и характере экспрессии РеАФП в етках опухолей человека в сравнении с экспрессией этого белка в нормальных тканях сьма ограничены и противоречивы (Мого R. et al., 1993; Laderoute M. et al., 1994; аршутина H.B. и др., 2001). Необходимым инструментом для проведения таких следований являются моноклональные антитела (МоАт). Кроме того, МоАт к РеАФП или ; фрагменты, по-видимому, могут быть использованы в качестве векторных молекул для здания методов направленной терапии и новых методов диагностики опухолей.
В связи с этим целью работы явилась характеристика МоАт к РеАФП в сравнении с АФП по их взаимодействию с культивируемыми in vitro опухолевыми клетками и исследование экспрессии РеАФП в образцах солидных опухолей человека с помощью охарактеризованного клона МоАт к РеАФП.
В соответствии с целью исследования были сформулированы следующие задачи: 1.) Количественная характеристика связывания МоАт к РеАФП в сравнении с АФП по их взаимодействию с культивируемыми in vitro опухолевыми и нормальными клетками человека. 2.) Количественная характеристика уровня эндоцитоза МоАт к РеАФП и АФП для культивируемых in vitro опухолевых клеток.
3.) Исследование влияния МоАт к РеАФП на выживаемость опухолевых клеток и на их чувствительность к действию цитотоксических лимфоцитов.
4.) Исследование экспрессии РеАФП опухолевыми клетками солидных опухолей человека с помощью МоАт к РеАФП.
Научная новизна работы.
В данной работе впервые показано, что количество сайтов связывания для МоАт к РеАФП 4-х клонов и для АФП при взаимодействии этих лигандов с культивируемыми in vitro опухолевыми клетками примерно одинаково, при этом связывание МоАт к РеАФП отличается более высокой аффинностью, чем связывание АФП. В то же время ни МоАт к РеАФП ни АФП не взаимодействовали с нормальными свежевыделенными лимфоцитами периферической крови человека. Показано, что МоАт клона 2В8 связываются с АФП-узнающим сайтом РеАФП, поэтому этот клон МоАт был отобран для иммуногистохимических исследований.
Обнаружено, что количество рецепторов АФП на клетках аденокарциномы молочной железы линии MCF-7Adr и карциномы яичника SKVLB, характеризующихся множественной лекарственной устойчивостью, превышает количество таких рецепторов на чувствительных клетках аденокарциномы молочной железы линии MCF-7*1 и карциномы яичника SKOV3, соответственно. Для резистентных опухолевых линий MCF-7Adl и SKVLB обнаружена также более высокая скорость рецептор-опосредованного эндоцитоза РеАФП, чем для чувствительных клеток MCF-7wt и SKOV3.
Впервые показано, что МоАт к РеАФП в концентрации 500 нМ способны повышать цитотоксическую активность цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) in vitro, а в более высокой концентрации - ее ингибировать.
С помощью МоАт к РеАФП клона 2В8 обнаружен высокий уровень экспрессии рецептора АФП на опухолевых клетках солидных опухолей и опухолевьк клетках
доброкачественной опухоли, имеющей эмбриональное происхождение, и отсутствие его экспрессии на клетках нормальных тканей и доброкачественных опухолей.
Практическая значимость исследований.
Обнаруженная высокая специфичность взаимодействия МоАт к РеАФП с опухолевыми клетками позволяет использовать эти антитела для иммуногистохимической диагностики злокачественных новообразований и делает возможным использование изученных МоАт для создания иммуносцинтиграфических методов диагностики онкологических заболеваний и создания на их основе противоопухолевых препаратов направленного действия.
Положения выносимые на защиту. 1.) МоАт к РеАФП человека клонов 5С6, 2В8 и 2Е1 специфически связываются с РеАФП на поверхности опухолевых клеток in vitro и интенсивно эндоцитируются опухолевыми клетками. МоАт клона 2В8 специфически связываются с АФП-узнающим участком РеАФП. 2.) МоАт к РеАФП клона 2В8 пригодны для иммуногистохимического исследования экспрессии РеАФП на срезах тканей как замороженных, так и залитых в парафин. 3.) МоАт к РеАФП способны индуцировать цитотоксическую активность лимфоцитов в этношении опухолевых клеток.
і.) МоАт к РеАФП способны выявлять опухолевые клетки злокачественных опухолей и эпухолевые клетки доброкачественных опухолей эмбрионального происхождения на гистологических срезах тканей человека.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на 1-м съезде иммунологов России (Сочи, сентябрь 1999), на 27-м Съезде международного >бщества по изучению онкофетальной биологии и медицины (ISOBM, Киото, октябрь-ноябрь 1999), на Второй международной ассамблее Аптека 2000 "Новые медицинские технологии" Москва, октябрь 2000), на 3-й конференции центрально-европейских стран по опухолевым іаркерам человека (Карловы Вары, февраль 2001), на П Российской конференции молодых 'ченых с международным участием (Москва, 24-27 апреля 2001), на 5-м Конгрессе РААКИ Современные проблемы аллергологии, иммупологии и иммунофармакологии" (Москва, іктябрь 2002), на конференции "Клиническая иммунология и клиническая медицина" Москва, май 2003), на 3 научной конференции и школе-семинаре для молодых ученых Белки-маркеры патологических состояний" (Астрахань-Москва, сентябрь 2003).
Апробация работы состоялась на совместной научно-методической конференции афедры клинической иммунологии и аллергологии ФППО ММА им. И.М. Сеченова и аборагории клеточной биохимии Московского НИИ медицинской экологии 3 ноября 2003 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 118 страница: машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, указателі литературы, содержащий ссылки на 195 источника. Диссертация иллюстрирована 2( рисунками, содержит 9 таблиц.
![Оптимизация режимов лечения больных бластным кризом хронического миелолейкоза с учетом лекарственной чувствительности бластных клеток in vitro [Электронный ресурс]](/i/i/4276/186521.png "Оптимизация режимов лечения больных бластным кризом хронического миелолейкоза с учетом лекарственной чувствительности бластных клеток in vitro [Электронный ресурс] Захарова Елена Станиславовна")
