Введение к работе
Актуальность темы
Поддержание гомеосгаза в макроорганизме достигается благодаря контролю над постоянными процессами пролиферации, дифференцировки и гибели соответствующих клеток. Понимание клеточной смерти как активного процесса, развивающегося в четком соответствии с заложенной в каждой клетке программой "самоубийства" привело к возникновению повышенного интереса к данному феномену в последние годы. Количество исследований, посвященных этому вопросу, растет лавинообразно, указывая на важность программной клеточной гибели или апоптоза в различных биологических процессах. Программная элиминация клеток играет важную роль в нормальном развитии тканей и органов в период эмбриогенеза, метаморфоза, гормон-зависимого тканевого роста и атрофии, в созревании лимфоцитов, а также в возникновении и росте злокачественных новообразовании.
Т-лимоциты играют ключевую роль в иммунном надзоре, то есть в распознавании и элиминации чужеродных или собстиенных клеток, измененных вследствии опухолевой трансформации или инфицирования вирусами и другими внутриклеточными агентами. Осуществление этой роли достигается благодаря распознаванию Т-клеткамн модификации аутологичных молекул главного комплекса гистосовместимосги вследствии их комплексирования с пептидными фрагментами чужеродных белков (вирусных, опухолеассоциированных и т.д.). Формирование способности Т-лимфоцитов распознавать свое и чужое и дифференцироваться в функционально-активные клетки происходит в тимусе благодаря процессам позитивной и негативной селекции (Ярилин и соавт., 1991, von Boehmer, 1994; Nossal, 1994). Данные процессы осуществляются под влиянием факторов микроокружения тимуса, под которыми понимают клетки, с которыми контактируют созревающие тимоцнты и их гуморальные продукты (Kendall, 1991). К клеткам тимусною мнкроокружения относят эпителиальные, дендритные, миоидные клетки, макрофаги, фибробласты и т.д. Важнейшими среди них считают эпителиальные клетки, которые вступают с тимоцитами в контакты и даже поглощают их внутрь и обволакивают отростками мембраны, а также выделяют ряд продуктов, как близкодействующих (цитокины), так и поступающих в кровоток (гормоны). Считается, что положительную селекцию тимоцитов осуществляют эпителиальные клетки тимуса, тогда как за осуществление
процессов элиминации потенциально аутореактогенных клонов
предположительно ответственны дендритные клетки. Расшифровка сигналов, : норыми обмениваются между собой эпителиальные клетки и тимоциты, позволит не только понять процесс развития Т-лимфоцитов, их функционального и клонального разнообразия, но и контролировать эти процессы и корригировать их в случае патологии.
Ранее в Институте иммунологии МЗ МП РФ была получена линия эпителиальных клеток из тимуса ребенка, получившая название HTSC (Sharova et all., 1993). Признаком эпителиальной природы является наличие в них кератина. Клетки HTSC экспрессируют на своей поверхности молекулы МНС I и II класса. В монокультуре они не пролиферируют и практически не выделяют гуморальных продуктов. При совместном культивировании с человеческими тимоцитами и активированными периферическими Т-лимфоцитами наблюдается активация клеток HTSC и секреция ими ряда цитокинов и гормонов тимуса, включая ai-тимозин. С другой стороны, в совместной культуре эпителиальных клеток и тимоцитов последние подвергаются апоптозу и исчезают к 3-4 суткам культивирования (Yarilin, Sharova, 1995). Можно предположить, что взаимодействие между эпителиальными клетками и Т-лимфоцитами in vitro моделирует аналогичные процессы, происходящие при селекции тимоцитов в тимусе in vivo, а данная система является удобной моделью для изучения гуморальных и клеточных сигналов и факторов, имеющих место при взаимодействии эпителиальных клеток тимуса и Т-лимфоцитов.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в изучении на примере клеточной линии HTSC способности эпителиальных клеток тимуса индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов и анализе природы контактных и іуморально-оііосредованньїх сигналов, обусловливающих апоптоз тимоцитов и зрелых Т-лимфоцитов при их взаимодействии с эпителиальными клетками тимуса.
В соответствии с этой целью в работе решались следующие ЗАДАЧИ:
1. Анализ взаимодействия различных фракций тимоциюв с эпителиальной
клеточной линией тимуса HTSC; установление взаимосвязи стадии
дифференцировки тимоцитов и подверженности их апоптозу при взаимодействии
с HTSC.
2. Анализ взаимодействия зрелых периферических лимфоцитов доноров с
HTSC; эффективность митогенов различной направленности действия в индукции
апоптоза активированных лимфоцитов эпителиальными клетками тимуса.
3. Изучение ноіможносін индукции аиошоэа ірансформироваїшьіх
лимфоцитов больных лимфолейкопіми и перевиваемых клеточных линий при
взаимодействии с IITSC.
4. Изучение роли Fas-amигена в HTSC-индуцнрованном апоптозе
лимфоцитов.
5. Анализ значения контактных и гуморальных взаимодействий между
тнмоцитами и клетками HTSC в индукции апоптоза тнмоцитов; роль пар молекул
CD4-MHC-II; CDS-MHC-1, CD2-CD5H; LFA-1-ICAM-I в HTSC-опосредованном
апоптозе.
-
Ингибиторный анализ H'ISC-нндуцированного апоптоза; эффект ингибиторов синтеза ДНК, РНК, белка, блокаторов микротрубочек и мнкрофиламентов.
-
Сопоставительный анализ апоптоза, вызванного клетками HTSC и другими факторами (облучением, глкжокортнкоидамн).
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ: Впервые исследовано взаимодействие лимфоидных и эпителиальных клеток тимуса в культуре с выяснением природы сигналов, обусловливающих индукцию апоптоза первых и активацию последних, а также анализом некоторых механизмов этих процессов. Данная работа вносит свой вклад в понимание природы процессов развития Т-клеток (в частности, селекции тимоцнтов и некоторых возможных механизмов, способных индуцировать программированную гибель периферических Т-лимфоцнтов), взаимодействий между эпителиальными и лимфоидными клетками, особенностей сигналов, приводящих к активации и апоптозу клеток, соотношения контактных и гуморальных факторов в их осуществлении.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ II ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ: Работа вносит существенный вклад в развитие общей иммунологии, а также медицины, обогащая их пониманием нскотрых этапов развития Т-клсток н особенностей взаимодействия последних с эпителиальными клетками тимуса.
Сделаны первые шаги в понимании природы сигналов, способствующих индукции апоптоза в трансформированных Т-лимфоцитах, что может явиться основой для дальнейшего изучения сигналов и факторов, способствующих данному процессу, и иметь важное практическое значение для возможности использования этих факторов в терапии лимфолейкозов.
Разработанная тест-система in vitro может быть использована при тестировании активности препаратов, в том числе для оценки действия фармакологических агентов на развитие лимфоцитов в тимусе, чувствительность Т-клеток к индукции апоптоза и выработку гормонов и цитокинов эпителиальными клетками.
1. Эпителиальные клетки тимуса линии HTSC вызывают апоптоз
предшественников Т-лимфоцитов (дубль-негативных (CD4-CD8-) и дубль-
позитивных (CD4+CD8+)) и не вызывают апоптоз зрелых (CD4-CD8+ и
CD4+CD8-) тимоцитов.
-
Клетки HTSC индуцируют апоптоз активированных периферических Т-лимфоцитов доноров, лимфоцитов больных Т-лимфолейкозами и клеток перевиваемых Т-клеточных линий.
-
Супернатанты от активированных HTSC вызывают апоптоз тимоцитов и Т-лимфоцитов.
-
Моноклональные антитела (МоАт) к CD95 (Fas, АРО-1), экспрессированному на поверхности тимоцитов и активированных Т-клеток, индуцируют апоптоз этих клеток; предварительная обработка МоАт к CD95 Т-клеток ведет к блокаде HTSC-индуцированного апоптоза последних.
-
МоАт, блокирующие взаимодействие между парами молекул LFA-1/1САМ-1 и CD8/MHC-I на поверхности тимоцитов и эпителиальных клеток соответственно ведут к отмене HTSC-опосредованного апоптоза.
-
Ингибиторы синтеза ДНК, РНК и белка блокируют HTSC-индуцированный апоптоз.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Диссертация апробирована на заседании секции N2 Ученого Совета Института иммунологии. По материалам работы опубликовано печатные работы.
ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ: Диссертация изложена на страницах
машинописного текста, содержит рисунка и таблицы. В списке литературы источника, из них -отечественных анюрон.
