Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Иммуномодуляторы 10
Классификация иммуномодуляторов 10
Клетки-мишени для иммуномодуляторов 13
Принципы иммуномодулирующей терапии 16
Основные подходы к изучению иммуномодуляторов 21
Полиоксидоний - иммуномодулятор нового поколения 23
Синтез полиоксидония 24
Первая стадия синтеза полиоксидония 25
Вторая стадия синтеза полиоксидония 26
Третья стадия синтеза полиоксидония 29
Изучение физико-химических и биологических свойств полиоксидония 31
Разработка технологии производства полиоксидония 31
Доклинические испытания препарата полиоксидония 32
Клинические испытания препарата полиоксидония 36
Применение полиоксидония в медицине 36
Фагоциты - основные клетки-мишени полиоксидония 43
Нейтрофилы 43
Мононуклеарные фагоциты 44
Анализ функциональной активности фагоцитов 45
Активация клетки 46
Адгезивная активность фагоцитов 47
Поглощение бактерий - собственно фагоцитоз 48
Кислород-независимые механизмы бактерицидности 49
Кислород-зависимые механизмы бактерицидности 51
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 55
Реактивы и оборудование 55
Выделение лейкоцитов на желатине 60
Подготовка образцов для цитометрического исследования взаимодействия ФИТЦ-меченого полиоксидония с лейкоцитами 60
Подготовка лейкоцитов для исследования методом лазерной сканирующей конфокальной цитоспектрометрии 61
Подготовка лейкоцитов для электронно-микроскопического исследования 62
Продукция внутриклеточного кальция лейкоцитами 64
Продукция внутриклеточной перекиси водорода лейкоцитами 65
Выделение мононуклеаров на градиенте фиколла-пака 66
Стимуляция МНК для продукции цитокинов 66
Определение цитокинов методом иммуноферментного анализа 67
Оценка поглотительной активности фагоцитов 67
Анализ внутриклеточного киллинга бактерий 68
Анализ хемилюминесценции нейтрофилов 69
Статистическая обработка результатов 69
Использованные в работе компьютерные программы и компьютерные базы данных 70
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 71
Взаимодействие полиоксидония с лейкоцитами периферической крови 71
Зависимость взаимодействия от концентрации 71
Динамика взаимодействия во времени 74
Сравнение степени взаимодействия полиоксидония с перевиваемыми клеточными линиями 74
Изучение проникновения полиоксидония в клетку 77
Лазерная сканирующая конфокальная цитоспектрометрия 77
Электронно-микроскопическое исследование 80
Анализ активации клетки под влиянием полиоксидония 85
Внутриклеточный кальций 85
Внутриклеточная перекись водорода 87
Продукция цитокинов под влиянием полиоксидония 90
Синтез провоспалительных цитокинов ИЛ-ір, ФНО-а, ИЛ-6 в культуре нестимулированных и стимулированных мононуклеаров 91
Синтез интерферонов а и у в культуре нестимулированных и стимулированных мононуклеаров 94
Влияние полиоксидония на фагоцитарное звено иммунитета 95
Поглощение и киллинг St. aureus 95
Хемилюминесценция лейкоцитов 98
ВЫВОДЫ 101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 102
ПРИЛОЖЕНИЯ 116
Введение к работе
Актуальность темы диссертации
В настоящее время наблюдается снижение иммунологической реактивности населения, что в целом приводит к повышению уровня острых и хронических инфекционных заболеваний, связанных с условно-патогенными и оппортунистическими инфекциями. На фоне подавленной иммунореактивности действие антибиотиков, а также противогрибковых, противовирусных и других химиотерапевтических препаратов зачастую является малоэффективным, поскольку их действие направлено на подавление размножения возбудителя заболевания, а конечная его элиминация зависит от факторов иммунитета. В связи с этим необычайно большой интерес врачей проявлен в отношении использования иммунокорригирующих препаратов в комплексной терапии больных с заболеваниями, характеризующимися вялым, рецидивирующим течением с устойчивостью к адекватной этиотропной терапии [Karaulov A.V., 1999; Wichmann G., 2002].
Для восстановления нормального функционирования иммунной системы следует применять только те препараты, которые зарегистрированы в России, как иммуномодуляторы. К препаратам, прошедшим клинические испытания и соответствующим требованиям Фармакологического государственного комитета России, предъявляемым к иммунотропным лекарственным средствам, относятся полиоксидоний, миелопид, тактивин, имунофан, ликопид, лейкинферон и некоторые другие [Пинегин Б.В., Сараф А.С., 2001].
Сейчас препаратом первого выбора для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушением иммунной системы, является полиоксидоний (ПО) - высокомолекулярное физиологически активное соединение, обладающее иммуномодулирующей, антиоксидантной, детоксицирующей и мембранстабилизирующей активностью. Полиоксидоний является одним из немногих отечественных и зарубежных иммунотропных препаратов, полностью соответствующих определению иммуномодуляторов. Это лекарственные средства, обладающие иммунотропной активностью, которые в терапевтических дозах восстанавливают функции иммунной системы (эффективную иммунную защиту) [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000]. На протяжении 7 лет полиоксидоний успешно применяется при лечении заболеваний, связанных с нарушением иммунной системы. Наряду с этим накапливается все больше информации по изучению биологического действия данного препарата в лабораториях и лечебных учреждениях.
Использование метода проточной цитометрии на сегодняшний день является наиболее информативным при изучении функционального состояния клеточных популяций, изменение которого анализируется при исследовании действия различных лекарственных веществ, в том числе и иммуномодуляторов. Преимущества проточной цитометрии - это возможность исследовать метаболизм и сигнальные пути отдельно взятой клетки, анализ большого числа клеток, а также высокая скорость, точность и простота постановки реакции [Tarnok А., 1996; Kobayashi Т. et al., 2004]. Дополнительное использование методов электронной микроскопии и конфокальной цитоспектрометрии позволяет определять локализацию изучаемого препарата в клетке и степень его накопления.
Цель работы
Целью работы явилось исследование механизма взаимодействия иммуномодулятора полиоксидония с клетками периферической крови человека на клеточном и молекулярном уровнях in vitro.
В ходе работы были поставлены следующие задачи:
1. Определить уровень взаимодействия полиоксидония с клетками периферической крови здоровых доноров in vitro.
2. Изучить взаимодействие полиоксидония с перевиваемыми клеточными линиями U-937 и Jurkat in vitro.
3. Оценить проникновение иммуномодулятора в клетки периферической крови доноров.
4. Проанализировать процессы активации клетки под действием полиоксидония.
5. Изучить иммуномодулирующий эффект полиоксидония на продукцию провоспалительных цитокинов и интерферонов мононуклеарными клетками.
6. Исследовать воздействие полиоксидония на фагоцитарную функцию лейкоцитов периферической крови человека.
Научная новизна
Впервые изучена степень взаимодействия полиоксидония с лейкоцитами периферической крови человека во времени и в зависимости от концентрации с помощью флуоресцеина-изотиоцианат (ФИТЦ)-меченого препарата - ФИТЦ-ПО -методом проточной цитометрии. Показано, что ПО в наибольшей степени связывается с фагоцитами и в меньшей - с лимфоцитами, имея линейную зависимость от концентрации.
Впервые проведено сравнение взаимодействия полиоксидония с перевиваемыми клеточными линиями U-937 и Jurkat методом проточной цитометрии. Выявлено сходное поведение ПО в отношении моноцитарной и лимфоцитарной линий, как с лейкоцитами периферической крови: наибольшая интенсивность взаимодействия ПО с линией U-937.
Впервые установлено, что ПО проникает в клетки периферической крови с помощью методов электронной микроскопии и лазерной сканирующей конфокальной цитоспектрометрии. Фракция ПО 5 кД проникает в фагоциты в 1,7 раз более интенсивно, чем в лимфоциты. Показаны моменты захвата ПО, меченого коллоидным золотом, с поверхности фагоцита и внутриклеточная его локализация в везикуле в цитозоле клетки.
Впервые проведен анализ активации клетки под влиянием ПО. Мобилизация внутриклеточнго кальция из клеточных депо, определенная с помощью флуоресцентного красителя Fluo-З на проточном цитометре, не повышается под влиянием ПО. Продукция другого маркера активации клетки, внутриклеточной Н202, оцениваемой по индикаторному красителю дихлорфлуоресцеина диацетату (ДХФ-ДА) проточной цитометрией, была статистически достоверно повышена после часовой инкубации лейкоцитов с ПО.
Впервые изучен иммуномодулирующий эффект ПО на продукцию провоспалительных цитокинов интерлейкина (ИЛ)-1р, фактора некроза опухоли (ФНО)-а, ИЛ-6 и интерферонов а и у в культуре мононуклеаров in vitro. ПО оказывает стимулирующее действие на секрецию ИЛ-1(3 и ИЛ-6. Выявлено, что в отношении ФНО-а ПО проявляет истинный иммуномодулирующий эффект, снижая повышенные и повышая пониженные уровни цитокина.
Практическая значимость работы
Детальное изучение механизма действия полиоксидония позволит практикующим врачам различных специальностей более целенаправленно применять иммуномодулятор с учетом патологии, касающейся определенного типа клеток, зная, какой эффект может оказывать иммуномодулятор на функции лейкоцитов. Полученные данные будут способствовать существенному улучшению эффективности лечения и профилактики всех видов заболеваний, при которых наблюдаются нарушения иммунной системы.
Результаты проведенных исследований проникновения ПО в клетку позволят провести анализ возможности создания антибиотика, конъюгированного с иммуномодулятором. Необходимость такого комплексного препарата была описана выше.
Предложенный в работе расширенный вариант изучения действия иммуномодулятора на клеточном и молекулярном уровнях позволит более детально подходить к изучению механизма действия новых иммунотропных препаратов in vitro.
