Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение контактных взаимодействий между иммунокомпетентными клетками и фибробластами приобрело актуальность в связи с тем, что была установлена их ключевая роль в регуляции физиологических (созревание и дифферен-цировка клеток иммунной системы, осуществление иммунного надзора, репарация) и патологических (воспаление, новообразования, аутоиммунные заболевания) процессов (Мишин 1982, Krzesicki 1991, Springer 1994, Thlele 1989). К настоящему времени накопилось достаточное количество данных, позволяющих утверждать, что результатом контактных взаимодействий являются функциональные изменения в клетках обеих контактирующих сторон. В различных экспериментальных моделях показано изменение синтеза коллагена (Hibbs 1981), пролиферации (Горлина 1992), экспрессии антигенов главного комплекса гисто-совместимостн (Watson 1995) и ряда генов (Werb 1989), а также некоторых морфологических характеристик фнбробластов (Maminishkis 1996).
Разнообразный функциональный спектр результатов межклеточного контакта предполагает модуляцию межклеточного взаимодействия различными факторами. Основные пути модуляции контактных взаимодействий иммуно-компетентных клеток и фнбробластов основаны на регуляции рецепторного аппарата клеток. Среди факторов, оказывающих влияние на процессы контактного взаимодействия, большое значение имеют цитокины и фактора роста (Piela-Smith 1992). При изучении межклеточных взаимодействий необходимо учитывать, что эти взаимодействия происходят in vivo в условиях постоянного контакта с экстраклеточным матриксом (ЭКМ), что также вносит существенные регуляторные изменения в этот процесс (Akiyama 1990). В связи с этим, представляет большой интерес возможность участия аг-макроглобулина (агМ) в модуляции контактного взаимодействия лимфоцитов и фнбробластов. Этот глнкопротеин ннгибирует протеиназы, переходя при этом из нативной в трансформированную форму (Gonias 1982). Особый интерес иммунологов ссгМ привлекает благодаря своей уникальной способности связывать ряд цитокинов и факторов роста, изменяя их свойства и функции (Borth 1992). Помимо этого,
агМ способен связываться с основным компонентом экстраклеточного матрик-са, коллагеном (Зорин 1995). Избирательность коллагена по отношению к на-тивной и трансформированной формам ct2M свидетельствует в пользу функциональной важности этого процесса. Уникальность и многообразие свойств ссгМ связано с присутствием в его молекуле нескольких активных центров, каждый из которых может выполнять различные функции (LaMarre 1991), с наличием нескольких типов клеточных рецепторов к молекуле ссгМ (Misra 1994), взаимодействие с которыми может приводить к функционально различным результатам, и с широким распространением в экстравазальных компартментах клеток, секре-тирующих агМ и несущих рецептор к нему (Moestrup 1990, Mosher 1986). Все это позволяет предположить важное значение агМ как регулятора различных клеточных функций и эффектов микроокружения на клетку и свидетельствует об актуальности задач, связанных с изучением свойств, метаболизма и функций агМ, которые до сих пор во многом остаются неясными, в частности, совершенно неизвестна возможность участия агМ в адгезии клеток и межклеточных взаимодействиях.
Цель и задачи работы
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния а:-макроглобулина на процесс и функциональные последствия контактного взаимодействия лимфоцитов и фибробластов. В связи с этим, были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать возможность и условия адгезии фибробластов к агМ.
-
Изучить влияние агМ на количественные показатели адгезии лимфоцитов периферической крови человека к монослою фибробластов на модели алло-генных фибробластов линии М-19 и ксеногенных фибробластов линии L929.
-
Изучить влияние агМ на популяционный состав лимфоцитов, адгезирую-щих к монослою аллогенных и ксеногенных фибробластов.
-
Разработать компьютерную систему анализа изображений для количественной оценки морфологии культуры фибробластов.
5. Исследовать морфологические изменения фибробластов вследствие контактного взаимодействия с лимфоцитами и модуляцию этого взаимодействия агЫ.
Научная новизна
Впервые показано, что 02М обладает некоторыми свойствами, сходными с имеющимися у белков ЭКМ, в частности, иммобилизованный агМ вызьшает адгезию и распластывание фибробластов. Описаны условия, необходимые для адгезии фибробластов к иммобилизованному агМ. Процесс адгезии фибробластов являлся активным, зависящим от дыхательного метаболизма и присутствия в среде двухвалентных ионов. Для успешной адгезии клеток была необходима иммобилизация агМ-плазмина, поскольку присутствие солюбилизированного ссгМ-плазмина в среде не вызывало адгезии клеток. Адгезия фибробластов наблюдалась только к трансформированной форме ссгМ, нативный агМ, так же как и плазмин, не проявляли эффекта.
Новыми являются данные о том, что обработка монослоя фибробластов CC2M приводит к увеличению адгезивности монослоя для лимфоцитов. Число прикрепившихся к монослою лимфоцитов возрастает в 2-2,5 раза. Необходимо отметить, что эффект о^М не зависит от конформационного состояния молекулы: и нативный, и трансформированный метиламином ссгМ увеличивают адге-зивность как аллогенных, так и ксеногенных фибробластов по отношению к лимфоцитам примерло в той же мере, что и схгМ-плазмин. Впервые охарактеризован популяционный состав лимфоцитов, адгезирующих к монослою фибробластов линий L929 и М-19. Если монослой фибробластов не обрабатывали агМ, то среди адгезирующих к фибробластам лимфоцитов значительную долю составляли В-лимфоциты. После обработки монослоя ссгМ существенно возрастал процент прикрепившихся Т-лимфоцитов. Как показал субпопуляционный анализ, предобработка фибробластов агМ приводила не к избирательному увеличению адгезии CD4+ или CD8+ Т-лимфоцитов, а увеличивала адгезивность фибробластов для обеих субпопуляций Т-лимфоцитов.
Получены новые сведения об изменении функционального состояния фиб-робластов при модуляции агМ их контактного взаимодействия с лимфоцитами. В качестве функциональной характеристики были использованы морфологические параметры фибробластов. Для оценки морфологических изменений в мо-нослойной культуре фибробластов разработана оригинальная компьютерная система обработки изображений. Было обнаружено, что ссгМ вносит существенные коррективы в результат контактного взаимодействия фибробластов с лимфоцитами, причем направленность эффекта агМ строго зависит от использованной концентрации. Краткосрочное уменьшение степени распластанности фибробластов вследствие контакта с лимфоцитами было предотвращено предобработкой фибробластов агМ-плазмином в низких концентрациях. Предобработка фибробластов ссгМ в высоких концентрациях не предотвращала краткосрочный эффект лимфоцитов, но к 24 ч культивирования приводила к проявлению совершенно новых последствий контактного взаимодействия с лимфоцитами, заключающихся в увеличении площади клеток, ядерно-цитоплазматического (Я/Ц) отношения и интегрального показателя плотности, что может характеризовать повышение уровня метаболизма фибробластов. Полученные в нашей работе результаты демонстрируют, что агМ способен не только участвовать в процессах адгезии фибробластов, но и модифицировать их свойства при контактном взаимодействии с лимфоцитами и влиять на функциональные последствия контактного взаимодействия. Обнаруженные новые функции агМ позволяют высказать предположение о том, что ссгМ, секретируемый в тканях, является одним из морфогенетических компонентов экстраклеточного матрикса, участвуя в регуляции межклеточных контактов и модулируя функции клеток за счет передачи сигнала через специфические рецепторы.
Практическая значимость
Разработанная система компьютерного анализа изображений отличается относительной простотой, экономичностью и возможностью модификации, что делает возможным ее широкое применение в научной практике и клинических
исследованиях для изучения морфологических характеристик клеток. Программа для оценки морфологии клеток в культуре внедрена в практику для изучения цитоморфологии иммунного ответа в норме и при патологических процессах в лаборатории клинической иммуногенетики Института Клинической Иммунологии СО РАМН. Результатом проведенных исследований явилась разработка проходящих стадию внедрения в научно-исследовательскую практику методов изучения контактного взаимодействия клеток, включающих оценку количественных и функциональных параметров контактного взаимодействия и их модуляции различными агентами. Полученные данные об индукции адгезии и распластывания фибробластов иммобилизованным азМ создают предпосылки для разработки методов выделения и культивирования клеток, несущих специфический рецептор к оггМ.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции отдела клинической и экспериментальной иммунологии РГМУ, на 9-ом международном конгрессе иммунологов (Сан-Франциско. 1995)
Публииации
По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Объем и структура работы
