Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: В последние годы накапливается все больше сведений о ключевой роли иммунной системы в развитии многих патологических процессов. Например установлено, что основными причинами хронизации неспецифических заболеваний легких, частых рецидивов и резистентности к терапии являются нарушения в системе им-мунореактивности с формированием вторичного иммунодефицита (Ширин-ский B.C., Сенникова Ю.А.,1994; Чучалин А.Г.,1995). Именно с увеличением группы людей с функциональной недостаточностью иммунной системы связывают тенденцию роста таких инфекционных заболеваний как грипп и вирусный гепатит (Покровский В.И.,1992).
Однако вопрос о функциях иммунитета, традиционно рассматривающийся на "протяжении многих лет с позиций прежде всего противоин-фекционной защиты, претерпел в последнее время сложную эволюцию. Накопились факты, свидетельствующие о том, что система иммунитета по своей природе является регуляторной и обладает функциями, выходящими за рамки традиционных представлений о защите. Установлено участие Т-клеточного звена иммунной системы в процессах репаратив-ной регенерации и индукции пролиферации гепатоцитов, клеток почки и тонкой кишки, клеток слюнных желез (Труфакин В.А., ШМаков А.Н., 1991). Обнаружено стимулирующее влияние Т-лимфоцитов на процессы пролиферации и дифференцировки коммитированных клеток-предшественников эритро- и гранулоцитопоэза в условиях действия на организм экстремальных факторов внешней среды, не оказывающих миелоингиби-рующего действия (ГольдОерг Е.Д. с соавт.,1983; Дыгай A.M. с со-авт.,1988). Доказано, что гомеостаз системы гемостаза поддерживается аутоантителами, образующимися против активированных факторов свертывания крови (Ильчевич Н.В.,1984; Кузник Б.И. с соавт.,1989).
Многочисленные взаимосвязи иммунной системы с нервной и эндокринной формируют гомеостатическую триаду, которая, осуществляя постоянный надзор, обеспечивает оптимальное состояние для выполнения той или иной функции (Корнева Е.А.,1984; Чернух A.M., Магаева С.В.,1984; Blalook J.Е.,1989; Сагг D.J.J., Blalook J.Е.,1989; Geenen V. et al.,1991). При этом выявлено регуляторное влияние не только нервной и эндокринной систем на иммунную, но и иммунитета на ЦНС и гормональные органы (Абрамов В.В.,1990; Kavelaars A. et ai.,1990; Невидимова Т.И., Суслов Н.И.,1995).
Активное участие системы иммунитета во многих жизненно важных процессах организма приводит к тому, что нарушения иммунореактив-
ности обуславливают широкое как функциональное, тек и структурное (патоморфологическое) многообразие проявлений патологий человека (Лозовой В.П.,1988). В связи с этим крайне актуальной становится проблема изучения патогенетических механизмов нарушения иммуноре-'активности и разработки подходов к объективной оценке иммунного статуса здорового и больного человека.
Комплексный анализ проблемы оценки иммунной системы человека, проведенный Л.В.Ковальчуком и А.Н.Чередеевым (1990), позволил выделить методические этапы изучения иммунного статуса, которые зависят от уровня знаний и методологической базы клинической иммунологии. Так, период с 1970 по 1990 год определяется как эмпирический, связанный прежде всего с введения понятий о клеточном и гуморальном звеньях иммунной системы и завершившийся созданием учения о структурном и функциональном единстве иммунитета и его главных компонентов. Настоящий период представляется как патогенетический этап, характеризующийся обоснованием методических приемов, позволяющих оценить функционирование основных компонентов иммунитета. Смена этапов определяется развитием знаний об иммунитете и постоянно повышающейся потребностью в более точных методах диагностики.
Действительно, с середины 80-х гг. стали накапливаться наблюдения, когда стандартный иммунологический анализ не позволял охарактеризовать причины и механизма недостаточности иммунитета при наличии выраженного клинического иммунодефицита, связанного, например, с частыми респираторными заболеваниями, ХНЗЛ, дисбактерио-зами и т.д. (Петров Р.В., Лебедев К.А.,1984; Ковальчук Л.В., Чере-деев А.Н.,1990; Westermann J., Pabet R.,1990; Маянский A.H.,1992; Покровский В.И.,1992; Петров Р.В. с соавт.,1995). С целью повышения информативности и диагностической значимости иммунологических параметров была предложена концепция "мобилей" (Петров Р.В. с со-авт.,1983). В основе данной концепции лежит представление об иммунологической норме организма не как об усредненных показателях им-мунореактивности человека, а как об интегральном состоянии, которое достигается совокупностью неоднозначных уровней отдельных параметров, характеризующих различные звенья иммунной системы.
Однако наряду с дискретно-динамическим подходом к оценке иммунного статуса человека существует и другое перспективное направление, позволяющее определять вровень иммунореактивности - изучение метаболических показателей лимфоцитов. Можно считать доказанным, что функциональное проявление лимфоцитов происходит только при соответствующем изменении внутриклеточных метаболических реак-
дай (Нарциссов Р.П.,1978; Робинсон М.В. с соавт.,1986; Труфакин I.A., Робинсон М.В.,1989; Труфакин В.А. с соавт.,1995). Так, обна-іужена активация ферментов гликолиза и гонтозофосфатного цикла в [имфоцитах при развитии реакции бласттрансформации (Keeter M.v. et J.,1977; Hume D.A. et al.,1978; Робинсон М.В. с соавт.,1986; cha-таЬаіЧі R.c. et ai.,1994). Доказана зависимость экспрессии на имфоцитах крови CD4- и сга-антигенов от внутриклеточной концент-ации аденозина и аденозиндифосфорной кислоты (Порядин Г.В. с со-вт.,1995). Обнаружена зависимость между геногаографией наслед-твенного дефицита Г6ФДТ и распространенностью туберкулеза легких Нисанов А.В.,1993).
Тем не менее, несмотря на ряд исследований по изучению актив-ости ферментов в лимфоцитах, многое остается неясным и'спорным. В ольшинстве исследований, характеризующих метаболические особенно-ти лимфоцитов при различных иммунных реакциях и состояниях реак-ивности, изучены уровни только отдельных ферментов, что не позво-яет обосновать метаболические механизмы функциональной активности «мунокомпетентных клеток. Прежде всего это связано с методическим эдходом в данных исследованиях. Так как при изучении активности яутриклеточных ферментов используются преимущественно цитохимиче-те методы, не имеющие четкого количественного выражения и требу-цие длительных временных затрат для обсчета результатов реакции, пи спетрофотометрические, нуждающиеся в большом объеме материала реактивов. По-видимому, по этой же причине отсутствуют комплексне исследования иммунологических показателей крови и уровней ме-эболических ферментов в лимфоцитах у людей как в норме, так и при атологии. В ряде работ отмечено развитие иммунодефицитов или гтоиммунного процесса вследствии нарушений взаимосвязей иммунной гстемы с нервной и эндокринной (Тронько Н.Д., Чеботарев В.Ф., 390; Volpe R.,1993; Балаболкин М.И. с соавт.,1995). Однако металлические процессы в патогенезе при данных состояниях не изучены, юме того, для выявления наиболее общих закономерностей в наруше-[ях метаболического статуса лимфоцитов у людей с иммунодефицитны-I и гиперактивными состояниями иммунной системы (в частности, не івисящими от внешних факторов) необходимы исследования обменных юцессов в иммунокомпетентных клетках у-жителей разных регионов.
Таким образом, проведение комплексных исследований на совранном методическом уровне, включающих изучение активности метабо-ческих ферментов в лимфоцитах, сопоставление этих данных с пока-телями иммунологического статуса и регуляторним влиянием органи-
зма у здоровых людей и лиц с иммунными нарушениями, проживающими в различных климато-географических условиях, позволит не только охарактеризовать метаболические механизмы нарушения иммунореактивности, но и продемонстрировать новые методические приемы изучения и диагностики иммунной патологии.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Установить особенности нарушения метаболического статуса лимфоцитов и иммуноэндокринного взаимодействия в патогенезе вторичных иммунодефицитов и гиперактивнрго состояния иммунной системы.
ЗАДАЧИ:
-
Установить особенности метаболических процессов в лимфоцитах крови у лиц с иммунодефицитами различной этиологии и гиперактивностью иммунной системы. Сопоставить с данными иммунологического анализа.
-
Установить особенности метаболических процессов в лимфоцитах крови у лиц с гипо- и гиперфункцией щитовидной железы.
-
Изучить зависимость метаболических ферментов лимфоцитов от уровней некоторых гормонов крови при снижении иммунореактивности организма человека.
-
Установить этнические и региональные особенности метаболических процессов в лимфоцитах и иммуноэндокринного взаимодействия при нарушениях иммунореактивности.
-
Установить половые особенности метаболических процессов лимфоцитов крови у здоровых людей и лиц с иммунодефицитами.
-
Методами математического анализа определить особенности во взаимосвязях метаболических показателей лимфоцитов с уровнем иммунореактивности организма и выделить общие закономерности в нарушениях метаболических процессов в лимфоцитах в патогенезе вторичных иммунодефицитов и гиперактивного состояния иммунной системы.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Впервые проведено комплексное исследование, включающее изучение активности метаболических ферментов в лимфоцитах в сопоставлении с данными иммунологического статуса и показателями концентраций основных гормонов крови у здоровых людей и лиц с иммунными нарушениями, проживающими в разных климато-географических условиях. Проведение данного исследования на современном методическом уровне с использованием строго количественных методов позволило получить информацию об особенностях метаболических процессов в лимфоцитах в патогенезе вторичных иммунодефицитов и гиперактивного состояния иммунитета.
Впервые на основе анализа общих и специфических изменений в уровнях активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у людей с иммунодефицитами вирусной и бактериальной этиологии сформировано представление о метаболическом механизме иммунологической недостаточности. Определена роль обменных процессов в различных компартментах иммунокомпетентных клеток и взаимосвязи между ферментами с энергетическими и пластическими функциями при снижении иммунореактивности. Впервые проведен комплексный анализ ферментативного статуса лимфоцитов у людей с аллергической и аутоиммунной патологией, на основе которого получена информация о метаболическом механизме гиперреактивного состояния иммунитета.
Впервые изучены уровни метаболических ферментов в лимфоцитах у лиц с гипо- и гиперфункцией щитовидной железы. С помощью сопоставления уровней активности и взаимосвязей НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов у людей с некомпенсированными и компенсированными формами патологии щитовидной железы доказана роль тиреоидных гормонов в поддержании метаболического статуса имг.іуноко>яіетантннх клеток. Установлены причины возможного развития иммунодофицитного состояния при гипотиреозе и гиперреактивности иммунитета притиреотоксикозе. Впервые для изучения взаимосвязей между концентрацией Т3 и уровняли метаболических ферментов лимфоцитов был использован нейросетевой предиктор.
Сравнительное изучение метаболических параметров лимфоцитов у коренных и пришлых жителей Эвенкии и Крайнего Севера, здоровых и с иммунными нарушениями, позволило исследовать на клеточном уровне л некоторые причины повышения частоты развития иммунодефицитных состояний и снижения выраженности аллергических проявлений при адаптации к новым климато-географическим условиям. Впервые показано, что срыв адаптационного процесса, проявляющийся в развитии иммунодефицитных состояний, на уровне клеточного обмена веществ выражается в обратных изменениях активности метаболических ферментов лимфоцитов относительно аналогичных показателей у здоровых людей.
Впервые механизмы иммуноэндокринного взаимодействия у здоровых людей и лиц с иммунодефицитами изучены на уровне взаимосвязей между основными гормонами крови и уровнями метаболических ферментов лимфоцитов. Доказано, что иммуноэндокринные взаимосвязи в меньшей степени зависят от концентрации гормонов, а определяются, функциональным состоянием иммунокомпетентных клеток. Впервые уста- '-. новлено иммуностимулирующее действие СТГ.
Впервые в качестве метода системного анализа использован ней-
росетевой классификатор, позволяющий оценить информативность исследуемых показателей здоровых людей и лиц с нарушениями иммуноре-активности, а также выделить из общих групп обследуемых людей подгруппы, значительно различающиеся по уровню и взаимосвязям введенных параметров.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ: Результаты изучения метаболических механизмов иммунодефицитных состояний и гиперактивности иммунной системы могут быть использованы для разработки профилактических мероприятий и методов "управления" иммунитетом. Полученная информация о. метаболических причинах повышения частоты развития иммунодефицитных состояний при адаптации к новым климато-географическим условиям позволяет рекомендовать биолюминесцентный метод определения активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов при отборе лиц, выезжающих в районы Севера.
Высокая информативность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов позволяет использовать метод их определения дли диагностики иммунодефицитов и гиперактивности иммунитета, а также для прогноза длительности инфекционных заболеваний, времени наступления ремиссий и частоты обострения. В настоящее вре:.м по результатам исследования получено авторское свидетельство на изобретение способа определения лиц, предрасположенных к респираторным заболеваниям. Биолюминесцентный метод определения активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах внедрен в качестве метода, тлеющего диагностическую и прогностическую значимость, в клинические лаборатории Краевого кожно-венерологического диспансера, Краевого клини-ко-иммунологического центра по борьбе и профилактике СГОЩ и Красноярского краевого противотуберкулезного диспансера. Компьютерная экспертная система выявления ш,мунодефицитных состояний по уровню метаболических показателей лимфоцитов на базе самообучающихся сетей внедрена в Краевом клинико-иммунологическом центре по борьбе и профилактике СПИД.
Разработанный биолюминесцентный метод определения активности НАД (Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов мокет быть модифицирован для анализа ферментов в любом биологическом материале. Так, в кли-нико-биохимическую лабораторию Краевой детской больницы (г.Красноярск) внедрен Оиолюминесцентный метод определения активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в плазме крови и в эритроцитах.
Полученные данные носят также фундаментальный характер и могут быть использованы для объяснения механизмов иммунологических
реакций у здорового человека и при патологии, а также при адаптации людей к новым клмато-гоогрофическим условиям.
-
Снижение метаболических процессов в лимфоцитах (прежде всего аэробных и пластических реакций) определяют функциональную недостаточность иммунной системы, а их повышение - гиперпкпшноо состояние иммунитета.
-
Экологические факторы модулируют интенсивность различных метаболических процессов в лимфоцитах с противоположной направленностью изменений в уровнях ферментативних реакций у здоровых людей и лиц с иммунодефицитами.
-
Регуляторное воздействие эндокринной системы на иммунокомпе-тентные клетки опосредуется и зависит от метаболической и соответственно функциональной активности лимфоцитов, в том числе и при адаптационных реакциях к новым климато-гэографическим условиям.
-
Уровни активности метаболических ферментов лимфоцитов позволяют объективно оценить их функциональное состояние, не зависят от субпопу ляционного состава иммунокомпетентннх клеток, что позволяет использовать данные показатели для диагностики иммунологических нарушений.
АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ: Основные результаты диссертации обсуждены на Всесоюзной конференции "Экологические аспекты иммунологических состояний" и заседании пленума Проблемной комиссии "Эпидемиология иммунодефицитов и оценка иммунного статуса" (Алма-Ата,1990); на Всесоюзной школе "Молекулярно-клеточные механизмы иммунной регуляции гомеостаза и проблемы математического мо-лирования" (Красноярск,1990); на 5 научно-практической конференции "Молодые ученые- практическому здравоохранению" (Красноярск,1990); на научно-практической конференции "Научно-технический прогресс и здоровье населения" (Красноярск,1990); на конференции "Экологическая патология и ее фармакокоррекция" (Чита,1991); на научной конференции "Актуальные проблемы внутриутробных инфекций: клиника, диагностика, лечение и профилактика" (Красноярск.1991); на научной конференции "Проблемы клинической и экспериментальной лимфологии" (Новосибирск,1992); на Сибирской конференции эндокринологов (Красноярск, 1993); на Республиканской конференции "Современные проблемы и методические подходы к изучению влияния факторов производственной и окружающей среды на здоровье человека" (Ангарск,1993); на Научной конференции молодых ученых России, посвященной 50-летию
АМН (Москва,1994); на Итоговой научной конференции Института медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск,1995); опубликованы в материалах мевдународных симпозиумов: International Congress on Circmnpolar Health (Yokou, 1990,Canada), IX International Congress on Ciroumpolar Health (Reykjavik,1993.Iceland), International Conference on Neural Information Processing (Seoul,1994,Korea), World Congress on Neural Networks (Washington,1995,USA), International Co-Conferenoe on "Environment Pollution (ICEP'95)" and "Neuroimmu-ne Interactions and Environment (ICONE'95)" (St-Petersburg,1995, Russia), The Second International Symposium on Neuroinformatics and Neuroooaputers (Rootov-on-Don, 1995,Russia).
ПУБЛИКАЦИИ: По теме диссертации опубликовано 63 работы в местной, центральной и зарубежной печати.
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИЙ: Диссертация изложена на 294 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и метода исследования", 5 глав, содвряшцих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы, включающего 379 источников.
Работа иллюстрирована 72 рисунками и 48 таблицей.
Всего обследовано 897 человек в возрасте 20-45 лет, проживающих в различных климато-географических условиях, здоровых и с нарушениями иммунореактивности. В г.Красноярске на базе Института медицинских проблем Севера СО РАМН и Краевого клинико-иммунологи-ческого центра по борьбе и профилактике СПИД обследованы лица с ХНЗЛ (в период ремиссии), ЧДБ ОРЗ (в период мевду заболеваниями), с острым вирусным гепатитами А и В и с аллергиями (до начала меди-коментозной терапии). На базе Краевого противотуберкулезного диспансера обследованы больные с фиброзно-кавернозной формой туберкулеза легких. Верификация диагноза осуществлялась врачами-специалистами на основе клинико-лабораторных данных. В качестве контроля обследованы практически здоровые индивида без хронической патологии, болеющие респираторными заболеваниями не чаще 2-х раз в год. Дополнительно в Краевом эндокринологическом центре проведено обследование людей с компенсированными и некомпенсированными формами гипотиреоза и тиреотоксикоза. Диагноз заболевания устанавливался врачами-эндокринологами на основе клинико-лабораторных данных.
Лечение больных гипотиреозом осуществлялось гормональными препаратами. Лечение больных тиреотоксикозом осуществлялось ы.ерказолилом.
В регионах Приангарья и Эвенкии обследования проводились в составе комплексных экспедиций Института медицинских проблем Севера СО РАМН. Группы здоровых людей и лиц ЧДБ ОРЗ, проживающих в Приангарье, сформированы на основании результатов осмотра врачей (терапевтов, хирургов, невропатологов, отоларингологов) и данных медицинской документации. Диагноз вторичного иммунодефицита у коренных и пришлых кителей Эвенкии ставился врачом-инфекционистом на основании клинического осмотра и данных медицинской документации. Аллергические заболевания у пришлых жителей Эвенкии диагносцирова-лись врачом-аллергологом. Обследование коренного (ненцы и коми) и пришлого населения, проживающего в-Европейской части Арктического региона (республика Коми), проведено в составе комплексной международной экспедиции организованной Архангельским филиалом Института физиологии РАН. Группы здоровых людей и лиц ЧДБ ОРЗ были сформированы на основании результатов осмотра врачей (терапевтов, пульмонологов, отоларингологов) и данных медицинской документацій.
Выделение лимфоцитов из венозной крови осуществляли в градиенте плотности фиколл-верографина. Концентрацию выделенных лимфоцитов определяли на счетчике "Ріоовоаіе ps-4".
Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ и содержание некоторых метаболитов (малата, глюкозо-6-фосфата, пирувата, НАД, НАДФ и АТФ) в лимфоцитах проводилось с помощью биолюминесцентного анализа по самостоятельно разработанным методикам. Для этого использовали ферментативную систему НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза, выделенную из светящихся бактерий Photobacterturn Іві-ognathi и Vibrio flscherl в Институте биофизики СО РАН (Тюлькова Н.А., Антонова Э.В.,1991). Данным методом определяли активность следующих ферментов: глхжозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глице-рол-3-фосфатдегидрогеназы (ГЗФДТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), ма-латдегидрогеназы (МДГ), малик-фермента (НАДФМДТ), НАД- и НАДФ-за-висимых глутаматдегидрогеназ (соответственно НАДТДТ и НАДФГДТ), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАДЖЩГ и НАДФИТЩГ), 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса (ОГДГК), пируватдегидро-геназного комплекса (ПДГК) и глутатионредуктазы (ГР). Уровни ЛДГ, МДГ, НАДФГДТ и НАДГДГ определяли как по прямым реакциям (по восстановлению НАД(Ф) до НАД(Ф)Н), так и по обратным (по окислению НАД(Ф)Н до НАД(Ф)). Активность оксидоредуктаз выражали в ферментативных единицах на 10 клеток, где I Е=1 мкмоль/мин (Строев Е.А.,
1986). Концентрацию малата, глюкозо-6-фосфата (Г6Ф), пирувата, НАД, НАДФ и АТФ выракали в М на I04 клеток.
Определение содержания катехоламинов и серотонина в лейкоцитах проводили люминесцентно-гистохимическим методом (Yokoo Н. et al.,1982) на мазках крови с последующим определением показателей на люминесцентном микроскопе ЛШАМ-РЗ.
Субпопуляционный состав Т-лимфоцнтов исследовали методом розе ткообразования с эритроцитами барана (Jordal м. et al.,1972; Лозовой В.П. с соавт.,1986). Для оценки функционального состояния иммунитета вычисляли иммунорегуляторный индекс и показатель функции тимуса (ПФТ). Концентрацию иммуноглобулинов классов А, и, G в сыворотке крови определяли методом радиальной иммушдиффузии (Кап-oini с et ai.,1965). Содержание ЦИК оценивали методом преципитации в полиэтиленгликоле (Hackova V. et al.,1978). Иммунологический анализ обследуемых людей производился на базе иммунологической лаборатории Краевого клинико-ишунологического центра по профилактике и борьбе со СІОДЦ (зав.лаб. Н.А.Шакина) и старшим научным сотрудником лаборатории вирусологии Института медицинских проблем Севера СО РАШ, к.м.н. А.Г.Борисовым.
Функциональное состояние лейкоцитов крови определяли через исследование поглощательной активности гранулоцитов по отношению к частицам латекса (на Оазе иммунологической лаборатории Краевого клинико-иммунологического центра по профилактике и борьбе со СПИД) и с помощью хемилшинесцентного метода. Исследование спонтанной и индуцированной хемилкминесценции лейкоцитов проводилось по самостоятельно модифицированной методике Geerding et al.,0985). В качестве активаторов индуцированной хемилшинесценции использовали опсонизированный зимозан и стафилококковый белок А.
В сыворотке крови радаоиммунохимическими и иммунофарментными методами определяли концентрацию тироксина (Т4), трийодтиронина (Т3), тиpeoглoбyJшнa (ТГ), кортизола, тестостерона, инсулина, со-матотропина (СТГ), свободного Т3 (РТ3), свободного Т4 (FT.), реверсивного Т3 (кг_) и тиреотропного гормона (ТТГ). Данные исследования проводились на Оазе Института медицинских проблем Севера СО РАМН и Краевого эндокринологического центра к.м.н. С.А.Догадиным.
Результаты исследований обрабатывались методами вариационной статистики и системного анализа с использованием микроэвм IBM/PC/AT286.
