Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1. АНГИОГЕНЕЗ И КЛЕТКИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ (ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ) 9
Введение 9
Структура VEGF и его рецепторов 10
Структура TSP-1 и его рецепторов 16
VEGF и TSP-1 - разнонаправленные регуляторы процессов ангиогенеза 21
Синтез VEGF и TSP-1 клетками иммунной системы 25
Клетки иммунной системы - мишени действия VEGF и TSP-1 27
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 34
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 41
3.1.Синтез мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1
клетками иммунной системы интактных мышей 41
Изучение способности клеток гепатомы синтезировать VEGF и TSP-1 in vitro..42
Исследование концентрации VEGF в сыворотке крови мышей в динамике роста опухоли 45
Инволюция тимуса при росте экспериментальной гепатомы 46
3.4.1. Влияние роста гепатомы на синтез мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2, и TSP-1
в строме тимуса мышей 49
Влияние роста гепатомы на синтез мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2, и TSP-1 в тимоцитах мышей 53
Синтез белка VEGFR2 в тимусе мышей 58
3.5. Влияние роста гепатомы на экспрессию мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2,
и TSP-1 в перитонеальных макрофагах мышей 60
3.6. Влияние VEGF на экспрессию мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2, и TSP-1 в
перитонеальных макрофагах интактных мышей in vitro 64
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ 83
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 84
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Клетки иммунной системы являются основным эффекторным механизмом, обеспечивающим антигенный гомеостаз организма. Считается, что иммунный надзор осуществляет контроль за появлением трансформированных клеток в организме. Однако, этот контроль не является достаточно эффективным вследствие развития иммунодепрессивных состояний, сопровождающих рост большинства опухолей. Хотя механизм, с помощью которого опухоли избегают иммунного надзора не вполне ясен, многие связывают его развитие с выделением различных иммуносупрессорных факторов, как самими опухолевыми клетками, так и нормальными клетками организма. В последнее время появились данные о том, что к таким факторам можно также отнести и ангиорегуляторные молекулы, такие как ростовой фактор эндотелия сосудов (VEGF) и белок внеклеточного матрикса тромбоспондин-1 (TSP-1). VEGF играет важную роль, в инициации неоангиогенеза и является необходимым компонентом опухолевой, прогрессии, в то время как TSP-1 является антиангиогенным фактором, оказывающим подавляющее влияние на рост клеток эндотелия в различных моделях.
Показано, что VEGF может оказывать ряд иммуносупрессорных эффектов; в частности вызывать развитие инволюции тимуса (Ohm et al., 2003). Инволюция тимуса сопровождает развитие многих опухолей человека и животных и может создавать основу для развития Т-клеточного иммунодефицита в организме. Изучение механизмов этого процесса является актуальным, поскольку разработка методов, препятствующих этому процессу, могла бы существенно увеличить продолжительность жизни онкологических больных. Одним из возможных механизмов действия VEGF является усиление апоптоза тимоцитов (Киселева, 2002). TSP-1 способен оказывать подавляющее действие на периферические Т-лимфоциты (Doyen et al., 2003), а также вызывать в них апоптоз (Manna, Frazier, 2003).
Многие опухолевые клетки продуцируют оба этих фактора (Lawler. 2002; Senger et al., 1986). Известно, что сывороточные концентрации VEGF при росте опухолей могут увеличиваться (Kondo et al., 1994), а уровень содержания TSP-1 может значительно варьировать и быть как пониженным, так и повышенным
(Tuszynski, Nicosia, 1996). Накопление VEGF и TSP-1 в циркуляции может оказывать системный эффект и подавлять нормальное функционирование иммунной системы.
Многие нормальные клетки организма и, в частности, клетки иммунной системы также способны синтезировать VEGF и TSP-1, что показано in vitro (Carpizo, Iruela-Arispe, 2000; Bottomley M.J. et.al., 1999). Мы предположили, что усиление внутриорганного синтеза VEGF и TSP-1 в тимусе может влиять на развитие Т-клеточного иммунодефицита при опухолевом росте. Поскольку хорошо известно, что активными продуцентами VEGF и TSP-1 и основными регуляторами ангиогенеза в организме являются макрофаги, мы проводили сравнительное изучение системного влияния опухолевого роста на тимус и перитонеальные макрофаги.
Перспективность исследования связана с возрастающим интересом клиницистов к применению антиангиогенных препаратов для лечения новообразований. В качестве мишеней для создания таких препаратов широко используются молекулы VEGF и TSP-1, причем без учета их иммуномодулирующих эффектов. Поэтому изучение синтеза VEGF и TSP-1 клетками иммунной системы является актуальной задачей исследования.
Цель работы. Оценка локального синтеза VEGF и TSP-1 в тимусе и перитонеальных макрофагах мышей при росте сингенной опухоли гепатома 22а.
Для этого решались следующие задачи:
Оценить изменение синтеза мРНК VEGF и TSP-1, а также рецепторов VEGF (VEGFR1 и VEGFR2) в клетках тимуса мышей в норме и при росте экспериментальной гепатомы.
Сопоставить эти изменения с изменением массы и клеточности тимуса и изменением уровня VEGF в циркуляции при росте гепатомы.
Изучить изменение синтеза мРНК VEGF и TSP-1, а также рецепторов VEGF (VEGFR1 и VEGFR2) в перитонеальных макрофагах мышей при росте гепатомы и сопоставить их с теми же показателями в клетках тимуса.
Оценить синтез мРНК VEGF, его рецепторов и TSP-1 перитонеальными макрофагами под действием VEGF in vitro.
Основные положения выносимые на защиту.
Инволюция тимуса при росте опухоли сопровождается усилением синтеза мРНК VEGF внутри тимуса и не сопровождается повышением уровня содержания VEGF в циркуляции.
Инволюция тимуса при росте гепатомы сопровождается усилением синтеза
мРНК VEGF в строме тимуса и мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах.
3. VEGF усиливает синтез мРНК своих рецепторов (VEGFR1 и VEGFR2),
экспрессию мРНК своей собственной молекулы, а также TSP-1 в макрофагах мышей in vitro.
Научная новизна. Впервые было показано наличие конститутивной экспрессии генов VEGF и VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах. Также установлено, что запустевание тимуса при росте гепатомы сопровождается повышением локального синтеза мРНК VEGF в строме тимуса и усилением экспрессии мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах. Нами впервые было показано, что в тимоцитах и макрофагах при росте опухоли наблюдается однонаправленное изменение синтеза мРНК VEGFR2. Кроме того, установлено, что экспрессия мРНК VEGF и TSP-1 в макрофагах может быть усилена в присутствии VEGF in vitro.
Теоретическое и практическое значение. Работа носит экспериментально-теоретический характер. На основании проведенных экспериментальных исследований дополнена концепция развития инволюции тимуса при росте опухоли, заключающаяся в локальном усилении синтеза мРНК ангиогенного фактора VEGF стромой тимуса и усилении синтеза мРНК VEGFR2 тимоцитами. При этом показано, что развитие инволюции тимуса, сопровождающее опухолевый рост, может не зависеть от повышения уровня VEGF в циркуляции. Дополнены данные по взаимодействию VEGF и клеток иммунной системы на примере влияния VEGF на синтез ангиорегуляторных молекул макрофагами.
Апробация. Основные результаты работы были представлены на четырех научных конференциях "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (2002-2006), на конференции молодых ученых «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань 2006) и Всероссийской конференции молодых ученых «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь 2006).
Материалы докладывались на заседании С.Петербургского отделения Российского научного общества иммунологов (2007).
Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН 18 декабря 2007г.
Публикации. Результаты работы отражены в 17 публикациях (4 статьи и 13 тезисов).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах, включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, полученные результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 48 рисунками. Библиографический указатель включает 177 литературных источников (10 отечественных и 167 иностранных).
