Введение к работе
Актуальность проблемы
Суточные (циркадные) ритмы сформировались в процессе эволюции для координации большинства важнейших функций организма (Reppert and Weaver 2001; Dunlap and Loros 2004; Okamura 2004) . Циркадные ритмы в организме млекопитающих координируются влияниями нейронов супрахиазматических ядер головного мозга (Asai, Yoshinobu et al. 2001; Koukkari and Sothern 2006), однако клетки периферических тканей и органов способны генерировать собственные ритмы и изменять их соответственно локальным потребностям (Balsalobre 2002; Albrecht and Eichele 2003; Hastings, Reddy et al. 2003). Гены, контролирующие суточные ритмы, так называемые «clock гены», описаны во многих периферических тканях и органах (Balsalobre 2002), однако в кроветворной ткани они детально не изучались. Нужно также отметить, что только несколько работ в этой области выполнены на клетках человека (Bjarnason, Jordan et al. 2001). Суточные ритмы в периферических тканях и органах формируются не только при получении координирующих сигналов от гипоталамических центров, но и при локальном воздействии факторов внешней среды, мобилизующих адаптационные процессы в данной ткани или органе (Balsalobre, Damiola et al. 1998; Balsalobre, Brown et al. 2000). Clock гены формируют оптимальные ритмы, координируя основные циркадные ритмы организма с локальными потребностями периферических тканей (Holzberg and Albrecht 2003). Таким образом, эти гены выполняют важную роль в поддержании клеточного и тканевого гомеостаза и непосредственно участвуют в регуляции многих процессов в клетках (Stokkan, Yamazaki et al. 2001). Поэтому, изучение активности clock генов в клетках кроветворной ткани представляет несомненный интерес.
До сих пор не проводились исследования суточных ритмов в кроветворных стволовых клетках (СК). Отсутствие данных об организации системы регуляции циркадных процессов в СК связано прежде всего с методическми сложностями изучения этих клеток. СК составляют очень небольшой процент ( 0.1 - 0.01 %) клеток костного мозга (Spangrude, Heimfeld et al. 1988; Weissman, Anderson et al. 2001), что вызывает медодические трудности в выделении за короткий период времени достаточного числа клеток без потери качества РНК для детального молекулярного анализа. Поэтому, задача разработки методики анализа циркадных генов в высокоочищенных популяциях кроветворных СК представляется безусловно актуальной.
Белки, кодируемые clock генами, и образуемые белковые гетеродимеры являются транскрипционными факторами, экспрессия которых меняется в соответствие с
клеточными циркадными ритмами. За счет измененния активности транскрипционных факторов может ритмично меняться и экспрессия подконтрольных им генов (clock-controlled genes) и соответственно клеточные процессы, этими генами опосредуемые . Такой механизм позволяет клеткам периферических тканей и органов быстрее и лучше адаптироваться к местным изменениям окружающей среды. Использование высокопродуктивных методов анализа экспрессии генов позволило получить представоение об эффекторном звене клеточных часов (Reppert and Weaver 2001). Так, при масштабном сравнительном анализе суточной экспрессии более 12000 генов в клетках печени и сердца удалось обнаружить, что активность около 10 % исследуемых генов меняется ритмично (Storch, Lipan et al. 2002). Интересно отметить, что процент одинаковых генов, изменяющихся ритмично в обоих органах, был небольшим. Эффекторное звено системы clock генов в кроветворной ткане до сих пор не исследовалось. Всвязи с этим, изучение молекулярно-генетических основ формирования суточных ритмов в кроветворной ткане - в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга, представляется безусловно актуальным.
Цель работы - изучение активности генов, контролирующих суточные ритмы кроветворения, в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга мышей и человека, сравнение особенностей формирования ритмов в кроветворных клетках разной степени дифференцировки.
Основные задачи работы:
-
Разработать методический подход для исследования экспрессии генов в редких популяциях стволовых клеток лабораторных моделей и человека.
-
Оценить экспрессию ключевых генов, контролирующих суточные ритмы -clock генов, в гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга мышей и человека.
-
Изучить изменение экспрессии clock генов в смешаной популяции клеток костного мозга мышей и популяции стволовых клеток, изолированных с помощью анализа методом проточной цитометрии и высокоскоростной сортировки.
-
Изучить изменение экспрессии генов, контролирующих суточные ритмы, в гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека.
5. Провести сравнительный анализ особенностей формирования суточных ритмов в
кроветворных клетках разной степени дифференцировки.
Научная новизна
Впервые проведена сравнительная оценка активности ключевых clock генов в кроветворной ткани костного мозга мышей и человека и исследованы изменения экспрессии этих генов в теченние суток. Показано, что регуляции ритмов в кроветворной ткани характеризуется особенностями, отличными от других тканей и органов. Впервые исследована система формирования суточных ритмов на молекулярно-генетическом уровне в стволовых клетках. Полученные результаты свидетельствуют о том, что экспрессия генов, контролирующих суточные ритмы гемопоэза в костном мозге, зависит от степени зрелости кроветворных клеток.
Теоретическая и практическая значимость
Разработан новый методологический подход, сочетающий использование высокоскоростной проточной цитометрическои сортировки и методы молекулярной биологии, для оценки суточных ритмов в редких популяциях кроветворных клетках. Использование этого подхода позволило впервые изучить организацию системы контроля суточных ритмов в кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга у мышей и человека.
Результаты работы используются в лекционном курсе «Общие представления о системе иммунитета» еа кафедре аллергологии и иммунологии ФПК MP ГОУ ВПО «Российский Университет Дружбы Народов» (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, Д. 10а).
Положения, выносимые на защиту
-
Сочетание высокоскоростной проточно-цитометрической сортировки и методов молекулярной биологии, позволяет изучать изменение активности различных генов в течение суток в редких популяциях кроветворных стволовых клеток.
-
Ключевые clock гены выявляются как в стволовых клетках мышей и клетках-предшественниках костного мозга человека, так и в неочищенных популяциях клеток костного мозга, однако регуляция ритмов в кроветворной ткане зависит от степени зрелости клеток.
-
Впервые показано наличие достоверных суточных ритмов в 3-х ключевых clock генах (hPerl, hPer2 и hCry2) клеток-предшественников костного мозга человека.
-
Экспрессия Bmall в течение суток в разных популяциях кроветворных клеткок мышей и человека, измененяется неритмично.
-
Изменение экспрессии генов, регулирующих суточные ритмы кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга, имеет особый характер, отличный от других периферических тканей и органов.
Апробация работы
Результаты исследований по диссертационной работе представлены на российских и международных конференциях и конгрессах: Международном конгрессе по иммунофизиологии (Дагомыс, 2003); International meeting on advanced flow cytometry (Paris, 2003); Danish meeting on flow cytometry (Copenhagen, 2004); Norwegian Stem Cell Network meeting (Rosendal, 2005); Norwegian Stem Cell Network meeting (Oslo, 2006), International Congress on Stem Cells (Cancun, 2006), Объединенном иммунологическом форуме - 2008 (Санкт-Петербург, 2008); Международной конференции по физиологии и патологии иммунной системы (Москва, 2008); Royan International Twin Congress on Regenerative Biomedicine and Stem Cell Biology and Technology (Tehran, 2008).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ (из них 9 - в международной печати), включающих 1 монографию, 1 главу книги, 7 журнальных статей и 9 материалов российских и международных конференций.
Объем и структура диссертаци
Диссертация изложена на 247 страницах, содержит 27 рисунков и 9 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 7 глав результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 317 источников (из них 293 - зарубежных).
