Содержание к диссертации
Оглавление , 2
Основные использованные обозначении и сокращения 7
Введение , 9
Актуальность проблемы 9
Цель работы 10
Основные задачи 10
Научная новизна и практическое значение работы 11
Материалы и методы исследования 11
Основные положения, выносимые на защиту 12
Содержание работы по главам 12
Благодарности 13
Глава 1. Обзор литературы , 14
1 Ниша для стволовых клеток 14
Ниша для кроветворных клеток 14
Основные свойства стволовых кроветворных клеток и их регуляция 17
Схема кроветворения 17
Регуляция самоподдержания и дифференцировки СКК 20
Мезенхимальная стволовая клетка 24
Функции паратиреоидного гормона 28
Свойства паратиреоидного гормона 28
Роль ПТГ в регуляции клеток стромы и гемопоэза 33
Глава 2. Материалы и методы , 36
Животные и их содержание 36
Условия облучения животных и культур клеток 36
Получение клеток костного мозга здоровых доноров 36
Пассирование клеток костного мозга человека 37
5 Длительные культуры костного мозга Декстеровского типа (32) 37
5Л Получение длительной культуры костного мозга мыши 37
5.2 Получение длительной культуры костного мозга человека 38
Определение количества КООБ 38
Получение и анализ КОЕ-С 39
Определение количества КОЕ-ГМ (агаровая культура клеток из суспензионной фракции ДККМ).., 39
Определение количества КОЕ-К (колоний в метилцеллулозе) 40
Определение интенсивности пролиферации предшественников разной степени зрелости 40
11 Проверка функционального состояния подслоев ДККМ после воздействия ПТГ...41
ИЛ Определение частоты кроветворных клеток-предшественников после
культивирования клеток КМ на предварительно обработанных ПТГ подслоях
ДККМ 41
Определение изменения количества "ниш" (выживания КООБ) после кратковременного культивирования клеток КМ на предварительно обработанных ПТГ подслоях/ДККМ 42
Сравнение способности стромалъных подслоев, предварительно обработанных ПТГ. поддерживать рост КООБ 42
Проверка способности клеток подслоя ДККМ формировать очаг эктопического кроветворения 42
Режим обработки мышей ПТГ 43
Получение очагов эктопического кроветворения 43
Метод конкурентной репопуяяции 43
Определение фактора оседания (Ф-24) СКК в КМ и селезенке 45
Подсчет клеток 46
Выделение геномной ДНК из селезеночных колоний и клеток подслоя ДККМ 46
Выделение РНК из анализируемых клеток 47
Выделение РНК 47
Определение количества и чистоты полученной РНК 48
19 Анализ геномной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) 49
20 Анализ экспрессии различных генов методом обратной транскрипции-
иолимеразной цепной реакция (ОТ-ПЦР) 49
Построение первых цепей ДНК на РНК 49
Полуколичественный анализ полученной кДНК методом ПЦР и Саузерн блот-гибридизации с изотопным мечением продукта реакции 50
Получение количественных данных экспрессии генов с помощью прибора Фосфоимаджер 53
Анализ результатов, полученных на приборе Фосфоимаджер 53
21 Методы статистической обработки данных 54
22 Иммуноцитохимия 56
22.1 FISH анализ 56
Приготовление препаратов хромосом 56
Флюоресцентная in situ гибридизация 57
Глава 3. Результаты 59
1 Влияние ПТГ на стволовые кроветворные клетки-предшественники 59
Изучение влияния ПТГ на функциональный статус ранних кроветворных клеток-предшественников 59
Анализ количества КООБ в КМ мышей, получавших ПТГ 63
Анализ количества КОЕ-С в КМ мышей, получавших ПТГ 64
Анализ количества КОЕ-К в КМ мышей, получавших ПТГ 64
Определение пролиферации клеток-предшественников 65
2 Влияние ПТГ на кроветворение в длительных культурах костного мозга мыши и
человека 66
2.1 Анализ кроветворения в культурах при добавлении ПТГ 66
Клеточная продукция в ДККМ мьшга и человека 66
Анализ количества КОЕ-ГМ и КОЕ-К в ДККМ мыши и человека, обработанных и не обработанных ПТГ 68
Анализ спектра кроветворных предшественников методом КООБ на разных сроках культивирования ДККМ мыши и человека 70
Пролиферация клеток-предшествепников в ДККМ мыши 73
Анализ экспрессии генов в стромальных подслоях ДККМ мыши и человека 74
5 2.2 Анализ кроветворения и адгезии кроветворнвіх клеток на стромалъных
подслоях ДККМ, предварительно обработанных ПТГ S3
Клеточная продукция в ДККМ мыши и человека после второй посадки КМ на подслои, обработанные ПТГ в различных концентрациях 83
Частота кроветворных клеток-предшественников после культивирования клеток КМ на предварительно обработанных ПТГ подслоях ДККМ мыши и человека 85
Определение изменения количества "ниш" (выживания КООБ) после кратковременного культивирования клеток КМ на предварительно обработанных ПТГ подслоях ДККМ 88
3 Влияние ПТГ на мезенхимальные стволовые клетки и строму кроветворных
органов 90
3.1 Анализ очагов эктопического кроветворения, сформировавшихся из КМ
мышей, предварительно получивших курс инъекций ПТГ 90
3.1.1 Определение веса костной раковины и клеточности трансплантатов,
сформировавшихся из обработанного ПТГ КМ 91
3.2 Анализ очагов эктопического кроветворения, формировавшихся из КМ во
время инъекций ПТГ 91
Определение веса костной раковины и клеточности трансплантатов, формировавшихся из КМ во время инъекций ПТГ 91
Характеристики кроветворных клеток-предшественников в очагах эктопического кроветворения, сформировавшихся из интактного КМ во время инъекций ПТГ 92
Анализ очагов эктопического кроветворения, сформировавшихся из клеток подслоя ДККМ, обработанной и не обработанной ПТГ 93
Влияние ПТГ на самоподдержание клеток, способных к переносу кроветворного микроокружения. 94
Влияние ПТГ на способность стромальных клеток ДККМ мыши и человека поддерживать рост КООБ 95
Изучение влияния ПТГ на взаимодействие стромальиого микроокружения с СКК 96
Фактор оседания КОЕ-С в КМ и селезенке 96
Фактор оседания КООБ в КМ и селезенке 97
Распределение КОЕ-С и КООБ в КМ и селезенке 97
Глава 4. Обсуждение 99
Заключение 108
Выводы 108
Печатные работы 109
Список использованной литературы , 111
Основные использованные обозначения и сокращения
БОЕ-Э - бурст образующая единица, эритроидная;
Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующии фактор;
ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колоииестимулируїощий фактор;
ГМП - предшественник гранулоцитов и макрофагов;
ДККМ -длительная культура костного мозга;
ДР-СКК - стволовая кроветворная клетка, способная длительно репопулировать облученное животное;
Ил - интерлейкин;
КИДК - клетки, инициирующие длительную культуру;
КМ - костный мозг;
КРЕ - конкурентно репопулирующая единица;
КР-СКК - стволовая кроветворная клетка, способная коротко репопулировать облученное животное;
КОЕ-Г - колониеобразующая единица, гранулоцитарная;
КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица, граиулоцитарно-макрофагальная;
КОЕ-М - колониеобразующая единица, макрофагальная;
КОЕ-К - колониеобразующая единица в культуре;
КОЕ-С - колониеобразующая единица в селезёнке;
КООБ - клетки, образующие область булыжника;
КР - кальциевый рецептор;
КРКМ - клетки, репопулирующие костный мозг;
ЛИФ - лейкемия-ингибирующий фактор;
ЛС - лошадиная сыворотка;
МАПК - митоген-активируемая протеинкиназа;
М-КСФ - макрофагальный колоииестимулируїощий фактор;
МП - мультипотентшый предшественник;
MCK - мезенхимальная стволовая клетка;
МЭП - предшественник мегакариоцитов и эритроцитов;
ОЛП - общий лимфоидный предшественник;
ОМП - общий мислоидиый предшественник;
ППК - подслой прилипающих клеток;
ПТГ - паратиреоидиый гормон;
ПТГпБ - ПТГ подобный белок;
ПТГ-Р - рецептор паратиреоидного гормона;
ЇЇЦР - полимеразная цепнаа реакция;
СКК - стволовые кроветворные клетки;
СФ - суспензионная фракция;
ТРФ-/3 - трансформирующий ростовой фактор-/3;
ФБ - фосфатный буфер;
ФИО - фактор некроза опухоли;
ФСК - фактор роста стволовых клеток;
ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка.
Введение к работе
1 Актуальность проблемы.
Кроветворение представляет собой процесс образования, по меньшей мере. 10 видов зрелых клеток крови, выполняющих совершенно разные функции. Клетки крови имеют короткий жизнепньш цикл и погибают в течение нескольких дней или месяцев. Основная масса клеток крови представлена конечными специализированными, неспособными к делению клетками. Поэтому в течение всей жизни происходит новообразование и созревание клеток крови в специальных кроветворных тканях - в костном мозге, селезенке, тимусе, лимфатических узлах. Известно, что в основе гемопоэза лежит стволовая кроветворная клетка (СКК). Большинство СКК находятся в стадии покоя клеточного цикла, и в каждый момент времени только несколько клеток поддерживают гемопоэз. Основополагающими свойствами СКІС являются способность к самоподдержанию, под которым понимают высокий пролиферативный потенциал, и к дифференцировкам в предшественники каждого из ростков клеток крови. Главным кроветворным органом млекопитающих является костный мозг (КМ), который обеспечивает специфическое микроокружение, необходимое для развития и поддержания пула стволовых клеток на протяжении жизни организма, а кроме этого регулирует процессы дифференцировки СКК. В норме гемопоэз поддерживается за счет взаимодействий между стволовыми клетками и стромой КМ (17,44,46). К строме КМ относят разные типы клеток: фибробласты, адипоцитьт, гладкомышечные клетки, остеобласты, хоидроциты, эндотелиальные клетки, а также вырабатываемый ими внеклеточный матрикс. Все эти элементы формируют кроветворные «ниши» (131), регулирующие функциональное состояние СКК и препятствующие потере их высокого пролиферативного потенциала. В настоящее время очень актуальна возможность воздействия на кроветворные «ниши» или на молекулы сигнальных путей взаимодействия СКК с микроокружением для стимуляции их роста, т.к. задача получения большого количества полноценных СКК имеет важное значение для лечения больных, нуждающихся в пересадке таких клеток.
Не так давно было установлено, что основным структурным элементом ниши являются остеобласты, количество и активацию которых можно регулировать с помощью паратиреоидного гормона (ПТГ). В организме ШТ регулирует обмен кальция и остеогенез. В зависимости от дозы и условий введения он может вызывать как увеличение массы кости (благодаря активации остеобластов), так и ее резорбцию (активируя
10 остеокласты). Показано, что СКК локализуются на эндостальной поверхности губчатой кости (49,106) и контактируют с веретеновидными остеобластами. Недавние эксперименты показали, что после инъекций небольших количеств ПТГ, сопоставимых с используемыми для лечения остеопороза (43), число самых ранних полипотеытных СКК увеличивалось в 2 раза, а мыши, восстановленные после летального облучения обработанным ПТГ костным мозгом, лучше выживали (15). Этот эффект связан с повышением экспрессии Jagged 1 - лиганда, локализованного на поверхности остеобластов, который взаимодействует с рецептором Notch 1, экспрессированным на поверхности СКК, Такое взаимодействие стимулирует пролиферацию СКК.
Таким образом, впервые был выявлен системный регулятор кроветворных ниш -паратиреоидиый гормон. В связи с этим, появилась возможность: во-первых -воздействовать на ранние кроветворные клетки-предшественники, чего раньше не удавалось, во-вторых - воздействовать на ниши СКК, и в-третьих - изучать регуляторные механизмы задействованные в этих процессах. Полученные результаты могут быть использованы в экспериментальной гематологии и работах по экспансии стволовых кроветворных клеток in vivo.
2 Цель работы.
Изучение влияния паратиреоидоого гормона на кроветворные клетки-предшественники из отделов поли- и олигопотеитых стволовых кроветворных клеток, на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения и на их потомков, in vivo и в длительных культурах костного мозга (ДККМ) мыши и человека.
3 Основные задачи.
Оценить основные характеристики кроветворения in vivo и изменения происходящие in vitro, в ДККМ мыши и человека под воздействием паратиреоидного гормона.
Изучить влияние паратиреоидного гормона на мезенхимальные стволовые клетки и строму кроветворных органов.
Проанализировать возможные изменения экспрессии некоторых важных генов, ответственных за поддержание стволовых кроветворных клеток, маркеров дифференцировок, молекул адгезии и ростовых факторов в стромальных клетках после воздействия паратиреоидного гормона.
4 Научная новизна и практическое значение работы.
В данной работе in vivo впервые было функционально показано, что применение паратиреоидного гормона (ПТГ), приводит к увеличению количества ранних полипотентных стволовых кроветворных клеток (СКК) в 2-4 раза, однако не оказывает действия на более поздние мультипотентные стволовые кроветворные клетки. Длительное введение ПТГ снижает способность коротко репопулирующих СКК попадать в костный мозг после трансплантации, чем может объясняться отсутствие экспансии зрелых клеток крови. Аналогичное действие паратгормона наблюдалось в модельной системе кроветворения - длительной культуре костного мозга человека и мыши. Добавление ПТГ не влияет на продукцию зрелых клеток, однако число поздних олигопотентных предшественников увеличивается в 7 раз, а в культурах мышиного костного мозга количество более ранних полипотентных предшественников увеличивается в 9-10 раз.
Полученные в работе данные выявили, что ПТГ не влияет на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения, действуя только на стромальные остеобласты и длительно репопулирующие СКК, что говорит в пользу возможного практического использования ПТГ в качестве фармакологического метода воздействия на СКК и стромальные клетки. На основе поученных данных, в настоящее время, в лаборатории физиологии кроветворения ведется работа по изучению влияния паратиреоидного гормона на стволовые клетки, в модельной системе, доноров и больных гематопролиферативпыми заболеваниями. Результаты работы применяются для изучения повреждений стромального микроокружения у больных апластической анемией в ГУ ГНЦ РАМН.
5 Материалы и методы исследования.
Получение длительных культур костного мозга мыши и человека и функциональные тесты проводились стандартными методами культивирования.
Функциональное состояние клеток-предшественников оценивали методом конкурентной репопуляции и в различных клопальных тестах, таких, как подсчет колониеобразующих единиц селезенки на 12 день (КОЕ-С 12)) в сублетально облученных мышах-реципиентах, подсчет колониеобразующих единиц культуры (КОЕ-К) в полужидкой среде, подсчет клеток, образующих области булыжника (КООБ), с использованием метода Пломахера. Интенсивность пролиферации клеток-
12 предшественников оценивали по доле клеток, чувствительных к воздействию цитостатиков.
Изменения функционального состояния ниш для кроветворных клеток под действием ПТГ определяли с помощью фактора оседания через 24 часа (Ф-24).
Экспрессию интересующих генов определяли методом обратной транскрипции и последующей полимеразиои цепной реакции, полуколичественную оценку продукта реакции проводили с помощью метода Саузерн-блот гибридизации.
6 Основные положения, выносимые на защиту.
Паратиреоидный гормон стимулирует пролиферацию и увеличение количества ранних стволовых кроветворных клеток к которым относятся наиболее примитивные стволовые клетки, способные длительно поддерживать кроветворение.
Введение паратиреоидного гормона не влияет па более зрелые мульти- и олигопотные клетки-предшественники.
Мезенхимальные стволовые клетки не чувствительны к воздействию паратиреоидного гормона.
Паратиреоидный гормон изменяет свойства компонентов стромального микроокружения, активирует остеобласты, регулирующие ранние СКК, и модулирует элементы васкулярной ниши, отвечающие за способность более поздних гемопоэтических предшественников находить свое место после трансплантации.
7 Содержание работы по главам.
Оглавление;
Основные обозначения и сокращения;
Введение;
