Введение к работе
Актуальность темы. На современном уровне знаний об иммунной системе целесообразным является- переход от эмпирических подходов при оценке иммунного статуса (каковыми являлись тесты 1-го и П-го уровней) к более совершенным, так называемым "патогенетическим" принципам, которые позволяют охарактеризовать основные механизмы функционирования иммунной системы как "единого целого" и установить уровень патогенетического дефекта (Ковальчук Л. В., Чередеев А.Н., 1990: Петров Р.В.. ПавлюкА.С., І987). При этом речь идет не столько о создании новых методик, сколько о разработке новых подходов в решении данной проблемы.
В связи с этим предлоаено условно разделить процесс функционирования иммунной системы на следующие компоненты: активация, пролиферация, дифференцировка и регуляция. Первым и основополагающим этапом в развитии иммунного ответа является активация клетки. Этот процесс представляет собой сложную последовательность молекулярных, метаболических, морфологических изменений, которые в конечном итоге приводят к прогрессии активированных лимфоцитов по клеточному циклу (Стенина М.А.. 1990).
Одним из признаков, отличающих стимулированные лимфоциты от покоящихся, является появление на их мембране активацион-ных маркеров (AM). Это группа молекул различной природы, которые объединены на основании следующих свойств: они синтези-
рувтся de novo в процессе активации клетки, и их экспрессия является необходимым условием для вступления в цикл (Afelt-га A. et al., 1993). ,
Первыми, спустя несколько часов после активации, на поверхности лимфоцитов- экспрессирувтся рецепторы для ИЛ-2 (РИЛ-2), а затем наблюдается аутокринный выброс ИЛ-2. Взаимодействие РИЛ-2 и ИЛ-2 является ключевым событием для реализации активационной программы лимфоцитов и приводит к экспрессии других активационных маркерои (ТФР, HLA-DR). Они хоть и не связывают ИЛ-2, но необходимы для его пролифератиэного эффекта (Matour D. et al., 1993).
В настоящее время, в связи с актуальность» данной проблемы, много научных работ посвящено установлению роли All на лимфоцитах периферической крови в норме и при имунопатологи-ческих состояниях (Corrlgan С. et al., 1991; Flser R. et al., 1991). Сформировалось мнение, что регистрация в циркуляции таких Т-лимфоцитов, получивших название "активированные", свидетельствует об нх участии в патогенезе того или иного заболевания. Однако конкретные характеристики . активированных лимфоцитов, особенно в отношении регуляторных субпопуляций (CD4+. CD8+). остаются малоизученкными.
Исследование процессов активации и экспрессии AM на лимфоцитах периферической крови (ПК) было выполнено у больных с впервые выявленным туберкулезом легких, поскольку хорошо известно, что ведущим в патогенезе заболевания является клеточ-но-опосредованныя иммунитет (Pieasens W. F.. 1989). Туберкулез легких отнесен к группе интерлеикинзависимых иммуиодефйцитоэ и имеет выраженный дефект в иммуноцитокиновой сети с дисба-
лансом регуляторних субпопуляций Г-лимфоцитов, свидетельствующем о феномене преактивации In vivo (Петров Р.В.. Пав-люк А.С., Ковальчук Л. В., 1987). Все это говорит о вкладе Т-лимфоцитов в несостоятельность клсточно-опосредованного иммунного ответа при туберкулезе легких. Поэтому нам представлялось вавным исследовать функциональную активность Т-клеток в отношении экспрессии AM на С04+ и CD8+ субпопуляциях лимфо-цитрв.
Для более углубленного изучения процессов активации целесообразно исследовать изменения Т-лимфоцитов под действием функциональной нагрузки, а качестве которой может быть использовано воздействие на лимфоциты In vitro митогена или антигена, а также иммуномодулирующих агентов, например, циклос-порина-А (ЦО'-А). Кроме того что ЦС-А широко используется в клинике как мощный иммунолепрессант, он является тонким инструментом изучения активационных' процессов иммунокомпетентных клеток In vitro (Baunann G., І992; Stutz A., 1992). Применение ЦС-А в системе in vitro, на нал взгляд, позволяет смоделировать определенные состояния и на основании этого изучить закономерности активации икмуноцитоз.
К наиболее адекватным методам, позволяющим исследовать фенотип интактных клеток и изменения, отражающие процессы активации, относят метод проточной цитофлуориметрии с использованием коноклональных антител (МонАт). Двухцветовая методика окрашивания с одновременным :пределекием дифференцировочкых (CD4, CD8) и функциональных маркеров (CDlib, CD2, CD25, CD71, H1A-DR) позволяет провести не только количественный, ко и качественный анализ на уровне регуляторних субпопуляций лимфо-
- і -
цитов, более точно локализовать дефект активационной способности Т-лимфоцитов (Вескшапп Е. et ah. 1987; Matour D. et al., 1393), Предлагаемый подход создает такве предпосылки для разработки методов патогенетически обоснованной шмунокоррек-ции.
Все зьшесказанное свидетельствует об актуальности проблемы, сэкзажой с изучением экспрессии и регуляции маркеров активации лимфоцитов человека в норме и при иммунопатологии,
Цель исследования.
Целью работы явилось изучение экспрессии и регуляции маркеров активации на CD4* и CD8+- субпопуляциях Т-лимфоцитоз человека методом двухцветовой проточной цитофлуориыетрии в норме и у больных с впервые выявленным туберкулезом легких.
Задачи исследования:
-
Сравнить экспрессию дифференцировочных и активацион-ных маркеров CD4+, CD8+ лимфоцитами, стимулированными ФГА в культуре in vitro, у здоровых доноров и больных туберкулезом легких.
-
Оценить влияние ЦС-А на субпопуляционкый состав Т-лимфоцитов (CD4+. CD8*. CD4+-CD45RA+, CD8+CD45RA*). стимулированных ФГА в культуре In vitro.
-
Изучить эффект ЦС-А на ФГА-стимулированную экспрессию активационных маркеров (CD25*. CD71+. HLA-DR) на CD1+, CD8+ лимфоцитах в культов in vitro у здоровых доноров и больных туберкулезом легких.
-
Сопоставить степень ишуносупресснвного влияния ЦС-А с ФГА-стимулированной активаций CD4+. CD8+- субпопуляций лимфоцитов человека в культуре In vitro.
Научная новизна.
С позиций патогенетического подхода изучения иммунного статуса человека разработан новый метод оценки функционального потенциала Т-лимфоцитов до и после активации ФГА, основанный на двухцветовом онраяивании клеток с использованием мо-ноклональных антител и проточной цитофлуориметрии. что позволяет определить содержание активированных лимфоцитов, несущих однввременно маркеры активации (CD25. CD71, HLA-DR) и диффе-ренцировки (CD4. CD8. CD45RA).
У здоровых доноров при культивировании лимфоцитов периферической крови In vitro в присутствии ФГА установлено увеличение относительного количества клеток CD9+ фенотипа при неизменном содераании CD4+ и CD45RA+ лимфоцитов, что подт-зерядает преимущественную пролиферацию CD8+ субпопуляции. Количество активированных (CD25*. CD71+, HLA-DR+) лимфоцитов среди CD4+ и CD8+- клеток прогрессивно увеличивалось в процессе культивирования с ФГА и достигало максимальных значений к 72 часам. Это говорит о схожести активациокных процессов для CD4.+ и CD8+ субпопуляций у здоровых доноров.
Обнаруаеко нарушение активационной и пролиферативной способности регуляторних субпопуляций (CD4*, CD8+) Т-лимфоцитов у больных с впервые выявленным туберкулезом легких ексудативного типа течения, оцениваемой по экспрессии AM (CD25, CD71, HLA-DR). Получены данные, свидетельствующие о более вы-рааенном угнетении активациьнной способности CD8+ субпопуляции у обследованных больных. Это подтверждается также особенностями действия ЦС-А на уровне регуляторних субпопуляций Т-лимфоцитов у больных туберкулезом легких в сравнении со
здоровыми донорами.
Зарегистрировано снижение общего количества поверхностных CD4 молекул на лимфоцитах у здоровых доноров и больных туберкулезом легких под действием ЦС-А. На основании зтих данных можно сделать предположение, что установленный эффект ЦС-А на экспрессии CD4 молекулы не зависит от степени активация CD4+ субпопуляции и является универсальный.
При исследовании влияния ЦС-А на экспрессии АЫ (С025. CD7i, HLA-DR) CD4+, CD8+ лимфоцитами, стимулированными СГА, проведен дифференциальный анализ клеток в зависимости от размеров и внутренней структуры, оцениваемых по оптическим характеристикам активированных лимфоцитов. Установлено, что ЦС-А ингибирует экспрессию AM на обеих регуляторних субпопуляциях Т-лимфоцитов. но степень супрессии зависит от уровня ФГА-индуцированной активации соответствующей субпопуляции. . При атом наиболее информативным оказался анализ лимфоцитов, соответствующих по размерам нестиыулированныы клеткам, так как именно изменения среди "малых" лимфоцитов скорее отракают истинную активации, чем крупные бласты. Применение такого дифференциального подхода позволило точно определить уровень иммунопатологического дефекта в процессе активации Т-лимфоцн-' тов у больных туберкулезом легких и супрессивном действии ЦС-А.
Практическая знь пшость работы.
Разработан новый подход к оценке иммунного статуса человека, позволяющий одновременно получать количественные и функциональные параметры, отражающие различные этапы активации регуляторних субпопуляций Т-лимфоцитов человека.
Сравнительшй анализ экспрессии CD25. CD71, HLA-DR молекул на CD4+ и CD8* лимфоцитах, под действием ыитогена, позволил определить уровень наруяения активационной способности иммунорегуляторных субпопуляция у больных с впервые зыявлен-ным туберкулезом легких, что создав-/ предпосылки для разработки методов патогенетически обоснованной иммунокоррекции.
Выявлены новые иммуномодулируюцие эффекты циклоспорине А на 'экспрессию дифференцировочных и акгивационных маркеров Т-лимфоцитами человека, главный из которых - снизение общего количества поверхностных CD4 молекул. Это должно быть перспективным при исследовании ВИЧ-инфицибельности.
Разработанный методический подход может быть применен для изучения патологических нарушений в Функционировании иммунной системы и оценки модулирующих эффектов иммунотропных фармакологических препаратов.
Апробация материалов диссрртзцкн.
Материалы диссертации доложены и обсуядены на симпозиуме РАМН "Цитокины при туберкулезе и другой патологии" (Москва, 1993г), на' меидународном симпозиуме "Использование приборов фирмы Becton Dickinson в научной и клинической практике" (Москва, 1993г), на конференции кафздры иммунологии РГМУ и отдела иммунологии ШЖ (Москва, 1995г).
Публикации.
По результатам выполненных исследований опубликовано 8 печатных работ.
Объем и структура диссертации.
