Введение к работе
Актуальность проблемы
Классические симптомы воспаления (отек, покраснение, жар и боль) являются результатом сложных биохимических процессов, возникающих в ответ на проникновение инфекции, чужеродного материала или поиреждэние тканей организма. Важнейшим признаком воспалительного процесса является проникновение лейкоцитов в очаг повреждения и инфильтрация ими пораженных тканей. Направленная миграция лейкоцитов в очаги воспаления опосредуется различными хемотаксическими факторами и их рецепторами В 19S6 году были впервые описаны члены семейства хемотаксических цитокинов (хемокинов)
низкомолекулярных консервативных белков, обладающих как структурным, так и функциональным сходством - способностью привлекать лейкоциты в очаг повреждения (Baggiolinietal, 1994).
Семейство хемокинов состоит из небольших (8-Ю кДа), индуцибельных белков, обладающих провоспалительной активностью и имеющих 20-50% гомолиі ии аминокислотной последовательности. Семейство хемокинов подразделяется на группу а-хемокинов, в молекуле которых между первым и вторым цистеиновым остатком содержится аминокислота (они также часто обозначаются как С-Х-С хемокины), и Р-хемокинов, в структуре которых первый и второй цистеин связаны непосредственно между собой (обозначаются как С-С хемокины), (Ben-Barachetal, 1995).
Одним из важнейших представителей семейства С-Х-С хемокинов является интерлейкин-8 (Ломакин И. и соавт., 1993). ИЛ-8 был открыт как хемотаксическнй фактор для нейтрофнлов, продуцируемый моноцитами периферической крови в ответ на стимуляцию бактериальным липополисахаридом (ЛПС) (Yoshimura et al, 1989). Дальнейшие исследования показали, что ИЛ-8 не является продуктом исключительно моноцитарно-макрофагального происхождения В настоящее время ИЛ-8 рассматривается как центральный медиатор неспецифической защиты организма, продукция которого клетками различных типов очень быстро инициируется под действием неспецифических факторов, таких как травма, изменения парциального давления кислорода, а также бактериальных продуктов (Baggiolini et al, 1994). Кроме тою, синтез ИЛ-8 в клетках различных типов индуцируется под действием провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухолей-а и интерлейкин-1 (Mukaida and Matsushima,1992, Кетлинский С и соавт., 1992).
Способность ИЛ-8, как и других хемокинов, вызывать миграцию лейкоцитов обусловлена наличием на поверхности последних специфических рецепторов. В 1991г были клонированы
4 два различных рецептора ИЛ-8 человека, рецептор типа 1, или А, и рецептор типа 2, или В
(Holmes et а/,1991; Murphy and Tiffeny, 1991). кДНК рецепторов кодируют белки размером 350
и 360 аминокислот, с гомологией аминокислотной последовательности в 77%.
Последовательности обоих рецепторов содержат семь трансмембранных доменов по 20-25
аминокислот с вероятной а-спиральной структурой, что является характерным для
рецепторов, связанных с G-белками. N-концевой участок и вторая экстраклеточная петля
содержат потенциальные сайты гликозилирования. .
В дальнейшем был описан выраженный полиморфизм рецепторних белков нейтрофилов, связывающих ИЛ-8, по молекулярной массе. Методом иммобилизации радиоактивно меченого лиганда на рецепторе при помощи перекрестно-сшивающих агентов было выявлено помеиьшей мере 4 комплекса лиганд-рецептор с различной молекулярной массой (Besemer et al, 1993). Причиной подобного полиморфизма может служить, с одной стороны, существование ранее не описанных рецеп горных белков, связывающих ИЛ-8, с другой стороны различия в молекулярной массе комплексов могут объясняться различными посттраисляционными модификациями известных рецепторних белков.
Рецептор ИЛ-8 первого типа является основным рецептором, обеспечивающим хемотаксис нейтрофилов человека а ответ на ИЛ-8 (Hammond et al, 199S). Экспрессия этого рецептора на других типах лейкоцитов может являться маркером; указывающим на возможность хемотактического ответа этих клеток на данный цитокин. Изучение экспрессии рецептора ИЛ-8 на лейкоцитах позволит глубже понять механизмы формирования тканевых инфильтратов, процессов рециркуляции лимфоцитов. Изменение уровня экспрессии рецептора ИЛ-8 на зрелых полиморфноядерных лейкоцитах может, по-видимому, служить одним из маркеров функционального состояния клеток - их способности реагировать на действие специфического агониста.
Не изучена экспрессия рецепторов ИЛ-8 на клетках-предшественниках кроветворения как в норме, так и при онкогематологической патологии. Известно, что клеточный состав воспалительного инфильтрата будет определяться спектром продуцируемых хемокинов с одной стороны и экспрессией специфических рецепторов и адгезивных молекул с другой. Важно отметить, что миграция и взаимодействие с основными группами адгезионных молекул лежит основе процесса иетастазнроваши. Можно предположить, что развитие лейкемнческих инфильтратов может определяться системой тканевых хемокинов, в частности, ИЛ-8 и хемокиновых рецепторов на лейкозных клетках. Не исключено, что рсцспгор ИЛ-8 первого типа может быть использован в качестве маркера дифференцировки клеток мнедоидного рада.
5 Поскольку ИЛ-8 является одним из важнейших медиаторов воспалительного процесса,
поиск и разработка специфических и селективных ингибиторов этого цитокина будет иметь
важное значение как для понимания механизмов воспалительного процесса, так и для
целенаправленного воздействия на звенья его патогенеза. Разработка методов определения
экспрессии рецептора на клетках является необходимой для изучения функциональных
характеристик клеток, их роли в формировании воспалительного инфильтрата. Специфичный
инструментом, пригодным для выполнения указанных задач являются моноклональные
антятела, пригодные для определения экспрессии рецептора методом проточной
цитофлуориметрии и способные ингибировать связывание ИЛ-8 с рецептором.
Цели настоящего исследования:.
а)изучить свойства поверхностных рецепторньгх белков ИЛ-8 на нейтрофилах человека и установить их возможное соответствие к продуктам экспрессии генов рецепторов ИЛ-8 первого и второго* типа; б) получить моноклональные антитела, способные специфически распознавать рецептор ИЛ-8 первого типа; в) изучить экспрессию рецептора ИЛ-8 первого типа на клетках периферической крови человека к «а клетках некоторых форм миело- и лимфолейкозов.
Задачи работы:
-
Изучить спектр рецепторньгх белков, связывающих ИЛ-8, на поверхности нейтрофилов человека методом иммобилизации радиоактивно меченого лиганда на рецепторах с последующим электрофоретическим разделением комплексов лиганд - рецептор.
-
Используя ретровирусные векторы, получить линии клеток на основе мышиных фибробластов BALB3T3, конститутивно экспрессирушщие фунциональные рецепторы ИЛ-8 первого и второго типа человека.
-
Сравнить свойства поверхностных рецепторних белков ИЛ-8 на нейтрофилах человека в сравнении с рецепторными белками, полученными при экспрессии кДНК рецепторов ИЛ-8 первого и второго типов.
4) Получить моноклональные антитела к рецептору первого типа ИЛ-8, способные
распознавать нативный рецептор на нейтрофилах человека.
5) Методом проточной цитофлуориметрии изучить экспрессию рецептора ИЛ-8 первого типа
на клетках периферической крови человека и на клетках некоторых форм миело- и
лимфолейкозов.
6) Изучить возможность получения специфического иммунного ответа при иммунизации
мышей линии BALB/c сингенными продуцентами искусственно экспрессированного
человеческого трансмембранного белка. Научная новизна
Полученные нами данные показывают, что рецептор первого типа ИЛ-8, синтезируется в эукариотических клетках в виде двух форм - основной 70 кДа и минорной 45 кДа. Впервые показано, что рецептор второго типа синтезируется в эукариотических клетках в виде двух форм - основной 58 кДа и минорной 45 кДа. Впервые показано, что продукты экспрессии кДЖ рецепторов ИЛ-8 первого и второго типа в эукариотических клетках соответствуют по молекулярной массе трем основным формам рецепторов ИЛ-8, обнаруженным на нейтрофилах.
Полученные моноклинальные антитела ЕЗ специфически связываются с N-концевой частью молекулы рецептора ИЛ-8 первого типа, пригодны для определения экспрессии рецептора ИЛ-8 первого типа человека методом проточной цитофлуориметрии на поверхности различных клеток и обладают способностью специфически ингибировать связывание лиганда.
Впервые изучена экспрессия рецептора ИЛ-8 первого типа на клетках различных форм -лимфо- и миелолейкоза. Показано, что рецептор ИЛ-8 первого типа не экспрессируется в определимых количествах на ранних клетках миелоидного ряда (миелоидная и миеломоноцитарная стволовая клетка) и может быть экспрессирован на более зрелых клетках -миелобластах, промиелоцитах и миелоцитах. Рецептор может также экспрессироваться на клетках некоторых форм лимфолейкоза, в частности, хронического В-клеточного лейкоза.
Практическая значимость
Получены линии клеток на основе линии мышиных фибробластов BALB3T3, конститутивно экспрессирующие рецепторы ИЛ-8 первого и второго типа человека. Данные линии могут быть использованы для изучения особенностей взаимодействия рецепторов с лигандами, а также получения специфических антисывороток и ыоноклональных антител к различным детерминантам рецепторов. Полученные ретровнрусные векторные конструкции, несущие і своем составе кДНК рецепторов ИЛ-8 первого и второго типа могут быть использованы для экспрессии рецепторов в различных клетках-мишенях.
Получены моноклональные антитела, распознающие натидный рецептор ИЛ-8 первого типа, пригодные для изучения экспрессии рецептора ка клетках методом проточной иигофлуориметрш и способные специфически ингибировать связывание лиганда. Использование антител к рецептору ИЛ-8 представляется перспективным для дополнительной феноішшчсской характеристики аейкозных клеток.
7 Положення, выносимые на защиту:
-
На поверхности нейтрофилов присутствует 3 основных белка, способных связывать ИЛ-8, с молекулярной массой 45, 58 и 70 кДа и минорный белок с молекулярной массой 37 кДа.
-
Продукты экспрессии кДНК рецептора ИЛ-8 первого типа в эукариотических клетках представляют собой два белка с мол. массами 70 и 45 кДа, а продукты экспрессии кДНК рецептора ИЛ-8 второго типа представлены двумя белками с мол. массами 58 и 45 кДа. Гетерогенность поверхностных белков нейтрофилов, связывающих ИЛ-8 связана с различными формами постгрансляционных модификаций известных генов рецепторов первого и второго типа.
-
Моноклональные антитела ЕЗ специфически распознают рецептор ИЛ-8 первого типа на нейтрофилах человека и рецептор, экспонированный на фибробластах при переносе кДНК рецептора ИЛ-8 первого типа и обладают способностью специфически ипгибировать связывание ИЛ-8 с рецептором.
-
Рецептор ИЛ-8 первого типа экспрессируется на нормальных периферических нейтрофилах, NK-клетках, небольшой субпопуляции моноцитов и Т-клеток.
-
Рецептор ИЛ-8 первого типа не экспрессируется в определимых методом проточной цитофлуориметрии количествах на ранних клетках миелоидного ряда (миелоидная и миеломоноцитарная стволовая клетка) и в некоторых случаях экспрессируется на более зрелых клетках - миелобластах, промиелоцитах и миелоцитах.
-
Рецептор ИЛ-8 первого типа экспрессируется на CD5+/CD20+ клетках в некоторых случаях хронического В-лимфоленкоза. Рецептор ИЛ-8 первого типа экспрессируется также на минорной субпопуляции CD 19+ тонзиллярных В-клеток.
Апробация диссертации
Материалы работы били доложены на IV съезде иммунологов и аллергологов Республики Беларусь (Гродно, 1995), Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 1996).
Публикации
Материалы диссертации опубликованы в 10 работах.
Обьем и структура диссертации
Диссеріация включает введение, главы "обзор литературы", "материалы и мегалы", результаты исследований в 4 главах, главу "обсуждение результатов исследований" и
8 выводы. Работа изложена на 94 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок, 3
таблицы и список использованных источников из ИЗ наименований.
![Изучение Р2-рецепторов в матке беременных женщин [Электронный ресурс]](/i/i/4397/186601.png "Изучение Р2-рецепторов в матке беременных женщин [Электронный ресурс] Зайцев Александр Петрович")