Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
В последнее время все больше внимания уделяется молекулярным механизмам репродукции и характеристике поверхностных структур сперматозоидов, определяющих способность клеток к оплодотворению. Изучение роли поверхностных белков важно для понимания механизмов фертилизации, причин бесплодия и для поиска адекватных способов коррекции нарушений репродуктивной функции.
Наиболее современным подходом к исследованию молекулярных механизмов взаимодействия клеток является использование моноклональных антител (МАТ). Получение МАТ к определенным антигенам (АГ) сперматозоидов позволяет изучать роль этих АГ в процессе оплодотворения. Исследуется возможность использования МАТ к АГ сперматозоидов при разработке новых способов иммуноконтрацепции (McCauley T.C. et al., 2002, Domagala A. et al., 2004).
Одним из белков, специфичных для сперматозоидов и привлекающих внимание исследователей, является тестикулярная изоформа ангиотензин-превращающего фермента, впервые описанная El-Dorry с соавторами (El-Dorry H.A. et al., 1982).
Ангиотензин-превращающий фермент (EC 3.4.15.1, CD143) – гликопротеин, расположенный на мембране клеток, выявляемый во многих тканях и жидкостях млекопитающих и имеющий широкий спектр действий. Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ) играет ключевую роль в ренин-ангиотензин-альдостероновой (РААС) и каликреин-кининовой системах, регулируя давление крови и гомеостаз электролитов (Hooper N.M., 1991, Corvol P. et al., 2004). АПФ – цинк-зависимая пептидил-дипептидаза, удаляющая C-концевой дипептид His-Leu, и осуществляющая превращение ангиотензина I в ангиотензин II (вазопрессор) и инактивацию брадикинина (вазодилятатор). АПФ может участвовать в метаболизме ряда других физиологически активных пептидов: вещества Р, энкефалинов, нейротензина, гонадотропин-релизинг гормона. Экспрессия АПФ была выявлена на поверхности эндотелиальных клеток легких, эпителиальных клеток кишечника, почек, нейроэпителиальных клеток мозга (Ryan J.W. et al., 1975, Danilov S.M. et al., 1987).
О важности РААС для процессов оплодотворения может свидетельствовать высокая концентрация АПФ в cеменной жидкости (СЖ), которая в 50 раз превышает концентрацию этого фермента в плазме крови (Depierre D. et al., 1978, Krassnigg F. et al., 1989). В 1982 году было описано наличие двух изоформ АПФ (El-Dorry H.A. et al., 1982), одна из которых, тестикулярная, расположена на поверхности сперматозоидов.
Было показано, что самцы мышей, у которых выключен (нокаутирован) ген АПФ, стерильны (Krege J.H. et al., 1995, Esther C.R. et al., 1997). В тоже время, при возобновлении экспрессии тестикулярной изоформы АПФ (тАПФ), но не соматической изоформы АПФ (сАПФ), фертильность у самцов мышей восстанавливается (Hagaman J.R. et al., 1998, Ramaraj P. et al., 1998, Kessler S.P. et al., 2000).
При попытках выявить связь между уровнем тАПФ и морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов были получены противоречивые результаты. В работе Kaneko с соавторами была отмечена позитивная корреляция между активностью АПФ и подвижностью сперматозоидов человека (Kaneko S. et al., 1984) и крупного рогатого скота. Однако, в более поздних работах выявлена негативная корреляция между активностью фермента и подвижностью сперматозоидов свиньи и человека (Siems W.E. et al., 1991, Khn F.-M. et al., 1998, Shibahara H. et al., 2001). В то же время, Khn с соавторами (Khn F.-M. et al., 1998) выявили отсутствие зависимости между уровнем активности АПФ и концентрацией/морфологией сперматозоидов. Использование фармакологических ингибиторов АПФ не оказывало влияния на подвижность сперматозоидов (Heder G. et al., 1994), но негативно отражалось на результатах взаимодействия сперматозоида и яйцеклетки (Foresta C. et al., 1991, Khn F.-M. et al., 1998). Было показано, что тАПФ высвобождается с поверхности сперматозоидов во время капацитации и акросомальной реакции (Khn F.-M. et al., 1995, 1998), тогда как ингибирование АПФ предотвращает акросомальную реакцию и проникновение сперматозоидов в яйцеклетку (Foresta C. et al., 1991).
Несмотря на то, что исследования в этой области идут уже не один десяток лет, механизм влияния тАПФ на фертильность до сих пор не изучен. Анализ ферментативной активности и использование поликлональных АТ не позволяют выявлять тАПФ, а оценивают суммарную активность/экспрессию как тестикулярной АПФ, экспрессирующейся на поверхности сперматозоидов, так и соматической АПФ, сорбируемой клетками из семенной жидкости.
Таким образом, основной проблемой, связанной с определением роли тАПФ in vivo, является отсутствие адекватных методов количественной оценки экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов. Следовательно, получение МАТ к тАПФ и изучение роли АПФ в репродукции является актуальной задачей.
Оценка экспрессии ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции, с помощью моноклональных антител.
-
Получить и охарактеризовать моноклональные антитела к тестикулярной изоформе ангиотензин-превращающего фермента.
-
Разработать метод количественной оценки ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов с помощью моноклональных антител.
-
Определить зависимость между экспрессией тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента и морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов.
-
Количественно оценить экспрессию тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции.
-
Определить возможность продукции антител к АПФ у мужчин с иммунным фактором бесплодия.
Впервые получены моноклональные антитела, обладающие высокой специфичностью к нативной конформации тестикулярной изоформы АПФ человека.
Показано, что слущивание тАПФ с поверхности живых патологически измененных сперматозоидов в ходе экспериментальных манипуляций приводит к ложно-негативным результатам при выявлении АПФ на поверхности клеток.
Разработан способ количественной оценки тАПФ на поверхности сперматозоидов человека с помощью моноклональных антител 1Е10 с использованием метода проточной цитометрии.
Уровень тАПФ на поверхности сперматозоидов зависит от морфо-функциональных характеристик клеток. Максимальный уровень экспрессии тАПФ выявляется на поверхности морфологически измененных сперматозоидов и функционально-активных сперматозоидов с нормальной морфологией. Снижение функциональной активности морфологически-нормальных сперматозоидов – уменьшение скорости поступательного движения и увеличение вероятности спонтанной АР, сопровождается снижением экспрессии тАПФ на их поверхности.
Обнаружено что на поверхности морфологически нормальных сперматозоидов тАПФ локализуется в постакросомальной области головки, на шейке и средней части хвоста сперматозоидов. У сперматозоидов с патологически измененной морфологией головки тАПФ экспрессируется на всей поверхности головки клеток.
Аутоантитела к АПФ в семенной жидкости фертильных доноров и пациентов с бесплодием иммунного и неиммунного генеза не выявлены.
Показано, что уровень экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов фертильных доноров выше, чем в группах пациентов с астенозооспермией и с бесплодием неясного генеза.
Результаты исследования и основные рекомендации внедрены в программу лекций кафедры иммунологии ГОУ ДПО Российской медицинской академии последипломного образования Росздрава, и в практическую работу лаборатории клинической иммунологии ГУ НЦ Акушерства, Гинекологии и Перинатологии РАМН.
Основные положения и результаты исследования представлены и обсуждены на Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004", "Ломоносов-2005" и "Ломоносов-2006" (Москва, 2004, 2005, 2006), Международной пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" (Пущино, 2004), Европейском конгрессе репродуктивной иммунологии (Плзень, Чехия, 2004), VIII, IX и X Всероссийских научных форумах "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2004, 2005, 2006), 15 и 16 Европейской студенческой конференции будущих врачей и молодых ученых (Берлин, Германия, 2004, 2005), Республиканской научной конференции "Иммунология репродукции" (Иваново, 2005), 13 Международном студенческом конгрессе медицинских наук (Гронинген, Нидерланды, 2006), на апробационной комиссии МГУ им. М.В.Ломоносова 17 октября 2006 года. Диссертация обсуждена на межклинической конференции ГУ НЦ АГиП РАМН 30 октября 2006 года.
По теме диссертации опубликовано 15 работ.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ
