Введение к работе
Актуальность проблемы. Заболевания, вызываемые вирусами группы герпеса, широко распространены в человеческой популяции. По данным ВОЗ, герпесвирусная инфекция занимает 2-ое место (15,8%) после гриппа и ОРВИ (35,8%) как причина смерти от вирусных инфекций. Антитела к вирусу простого герпеса обнаруживаются у 80-90% взрослых людей и у 50% детей, достигших десятилетнего возраста [Шувалова Е.П., 2001; Покровский В.И. и др., 2000; Львов Н.Д. и др., 1999; Баринский И.Ф. и др., 1986; Johnson R.E. et al., 1986]. Наибольшую опасность герпетическая инфекция представляет для беременных в связи с возможностью проникновения вируса через плацентарный барьер, последующим внутриутробным инфицированием плода и возможной его пре- или постнатальной гибелью [Исаков В.А. идр., 1999; СухихГ.Т. идр., 1997; ЦинзерлингА.В. идр., 1988;, Баринский И.Ф. и др., 1986]. У пациентов, находящихся на иммуносупрессивной терапии после трансплантации органов, реактивация герпесвируснои инфекции может приводить к развитию симптомокомплекса хронического отторжения трансплантата вследствие поражения его сосудов. Распространенный характер герпес приобретает у субъектов с онкологическими, гепатологическими заболеваниями [Кологривова Е.Н. и др., 2000]. Кроме этого, в настоящее время рецидивирующий герпес рассматривается как СПИД-индикаторное состояние, поскольку рецидивы заболевания чаще возникают на фоне иммунодефицита [Покровский В.И. и др., 2000]. Также, имеются данные об участии вирусов группы герпеса в патогенезе атеросклероза кровеносных сосудов человека [Vercellotti G.M., 2001,1998; Herzum М. etal, 1998; HajjarD.P., 1991].
Вирус простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) является одним из наиболее известных вирусов группы герпеса. Обычно, после инфицирования контактным, воздушно-капельным или вертикальным путем, развивается острая стадия инфекции, которая затем переходит в хроническую или латентную форму. Различные провоцирующие факторы (переохлаждение, стресс, травма, иммуносупрессивные состояния) способствуют манифестации инфекции из латентного состояния. Вирус герпеса сохраняется в организме пожизненно, как правило, в клетках паравертебральных сенсорных ганглиев, используя латенцию как механизм для поддержания своей жизнеспособности в организме хозяина и для уклонения от воздействия его иммунной системы [Mossman K.L, 2002; Rajcani J. et al., 2000; Everett R.D., 2000;
Millhouse S. et al., 2000; Roizman В., 1999; Miller C.S., 199В;Й)^і8аЦй^лЛ8?&()?9'1;
і БИБЛИОТЕКА I
І СПтрЬфг ,,$ t
з Fraser N.W. et al., 1991]. К настоящему времени известно, что ВПГ-1 может инфицировать не только эпителиальную и нервную ткани; вирус обнаруживается также в эндотелиальных клетках (ЭК) сосудов роговицы [Klein R. J., 1982], плаценты [Сухих Г.Т. и др., 1997; ЦинзерлингА.В. и др., 1988;], мозга [Stumpf Т.Н. etal., 2002; HolbachLM.etal., 1998].
Эндотелий, выстилающий внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, является естественным барьером между кровью и тканями организма и играет важную роль в регуляции проникновения циркулирующих клеток и молекул в ткани, то есть является одной из основных клеточных систем, участвующих в поддержании гомеостазаорганизма [Фрейдлин И.С. идр., 2001; Biedermann B.C., 2001; Cines D.B. et al., 1998; Beilke MA, 1990; Pober J. et al., 1990; Springer ТА, 1994]. Функционирование эндотелия регулируется гладкомышечными клетками (ГМК) стенки кровеносных сосудов и лейкоцитами крови путем продукции цитокинов, хемокинов и факторов роста. Эти же факторы участвуют в развитии большинства известных физиологических и патологических процессов, таких как рост, дифференцировка и миграция клеток, воспаление, репаративные процессы, реакция на инфекционные агенты [Pozo М.А. et al., 1996; Springer ТА, 1994; Mantovani A. et al., 1992; Shimizu Y. et al., 1992]. В отдельных случаях цитокины способны активировать распространение инфекционных агентов по организму [Campbell I.L., 1991]. С другой стороны, и резидентные (ГМК и ЭК), и циркулирующие в крови типы клеток способны воздействовать на клеточные и гуморальные типы эффекторных механизмов иммунитета благодаря активации продукции цитокинов [Mossman T.R. etal., 1996; Farby Z. etal., 1993]. Таким образом, эндотелиальные, гладкомышечные клетки интимы кровеносного сосуда и лейкоциты крови являются основными типами клеток, постоянно взаимодействующих на уровне кровотока и сосудистой стенки, как в норме, так и при развитии патологического процесса. Однако, влияние гладкомышечных клеток интимы сосуда и лейкоцитов периферической крови на инфекцию эндотелиальных клеток ВПГ-1 до настоящего времени не было изучено.
В этой связи исследование особенностей межклеточных взаимодействий при инфекции ВПГ-1 в многоклеточной модельной системе может дополнить представления о патогенетических механизмах вирусных заболеваний человека.
Цель исследования - изучение роли межклеточных взаимодействий с участием гладкомышечных клеток интимы сосуда и лейкоцитов периферической
крови человека в иммунопатогенезе инфекции эндотелиальных клеток, вызванной ВПГ-1.
Задачи исследования:
1. Разработать экспериментальную модель инфекции ВПГ-1 с использованием
культивируемых эндотелиальных клеток человека и охарактеризовать ее по
основным морфологическим и функциональным параметрам
Охарактеризовать особенности развития герпетической инфекции и продукции цитокинов в культивируемых эндотелиальных клетках, полученных от разных доноров, а также в клональных популяциях культуры эндотелия.
Исследовать экспрессию молекул клеточной адгезии эндотелиальными клетками, инфицированными ВПГ-1, и ее взаимосвязь с процессом адгезии лейкоцитов на инфицированный эндотелий.
Изучить продукцию цитокинов лейкоцитами крови при взаимодействии с эндотелиальными клетками, инфицированными ВПГ-1. Выявить влияние цитокинов и интерферонов, продуцируемых при этом взаимодействии, на инфекционный процесс и экспрессию молекул клеточной адгезии в культурах эндотелиальных клеток.
Исследовать влияние гладкомышечных клеток интимы сосуда и отдельных цитокинов на репродукцию ВПГ-1 в культуре эндотелиальных клеток человека.
6. Сравнить продукцию цитокинов лейкоцитами крови при инфекции вирусом и при
трех вариантах индукции: вирусом и вирусинфицированными эндотелиальными
клетками и вирусинфицированными лейкоцитами.
Научная новизна. Впервые разработана культуральная модель, позволяющая оценивать влияние гладкомышечных клеток интимы сосуда и лейкоцитов периферической крови на развитие герпесвирусной и других инфекций в культивируемых эндотелиальных клетках человека.
Впервые установлено, что клеточные популяции, полученные из отдельных родоначальных колониеобразующих эндотелиальных клеток, а также культуры эндотелия от разных доноров, различаются по способности поддерживать репродукцию ВПГ-1 и продуцировать цитокины.
Показано, что с развитием вирусной инфекции фенотип эндотелиальных клеток меняется на провоспалительный, который характеризуется экспрессией на клеточной поверхности Р- и Е-селектинов и усилением адгезивных свойств эндотелиальных клеток для лейкоцитов периферической крови, что отражает начальные стадии патогенеза герпетической инфекции.
Впервые выявлено, что при контакте с эндотелиальными клетками, инфицированными ВПГ-1, лейкоциты периферической крови активируются и продуцируют интерфероны (ИФНа, ИФНу) и цитокины (ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОа). которые тормозят репродукцию ВПГ-1 в культурах эндотелия и меняют фенотип клеток на провоспалительный. Эти процессы могут приводить к формированию латенции вируса в эндотелии и развитию порочного круга воспаления в сосудистой стенке.
Впервые показано, что гладкомышечные клетки интимы кровеносного сосуда в условиях со-культивирования тормозят, а в отдельных случаях полностью ингибируют репродукцию ВПГ-1 в эндотелиальных клетках.
Сравнительный анализ цитокинов, продуцируемых лейкоцитами крови при различных типах взаимодействия с вирусом показал, что индукция лейкоцитов ВПГ-1, а также эндотелиальными клетками или лейкоцитами, инфицированными ВПГ-1, приводит к секреции схожего спектра интерферонов и цитокинов, обладающих провоспалительный и противовирусной активностью. В тоже время, инфекция лейкоцитов ВПГ-1 сопровождается снижением продукции цитокинов, обладающих противовируснойактивностью.
Научно-практическая значимость работы. Разработанная модель со-культивирования эндотелиальных клеток, инфицированных ВПГ-1, с гладкомышечными клетками интимы сосуда и лейкоцитами крови может быть использована для изучения механизмов патогенеза вирусных инфекций, тестирования противовирусных препаратов и разработки новых способов лечения вирусных заболеваний человека.
Способность цитокинов, продуцируемых активированными лейкоцитами, подавлять репродукцию ВПГ-1 в эндотелиальных клетках может быть учтена при разработке подходов ктерапии герпесвирусныхзаболеваний.
Полученные данные позволяют расширить современные представления о клеточной биологии сосудистой стенки человека и механизмах развития сосудистой патологии, связанной с инфекцией ВПГ-1.
Апробация работы. Апробация диссертационной работы состоялась 6 ноября 2003 года на конференции Отдела интерферонов ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. Основные результаты исследований представлены на симпозиумах Международного общества исследований интерферона и цитокинов (Амстердам, Нидерланды, 2000 г., Турин, Италия, 2002 г.); на международной научно-практической школе-конференции "Цитокины.
6 Воспаление. Иммунитет." (Санкт-Петербург, Россия, 2002. г.); на конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, Россия, январь, 2004 г.)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 142 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и указателя литературы. Список литературы содержит 20 отечественных 243 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 4 таблицами.
