Введение к работе
Актуальность проблемы
Всемирная организация здравоохранения относит герпесвирусные инфекции к группе болезней, определяющих будущее инфекционной патологии. Они занимают второе место среди вирусных поражений человека, уступая только гриппу [Никонов А.П., Асцатурова О.Р., 2003].
Герпес называют «многоликим» и «коварным», имея в виду многообразие проявлений болезни и сопутствующих симптомов.
По тератогенности вирус простого герпеса занимает второе место после вируса краснухи [Мельникова В.Ф., 1988; Макацария АД., Долгушина Н.В., 2004]. Внутриутробная герпетическая инфекция — неуправляемая причина перинатальной смертности, заболеваемости и ранней детской инвалидности [Кудашов Н.И., 1993].
Рецидивирующая герпетическая инфекция по существу является и болезнью иммунной системы, так как длительная персистенция вируса сопровождается продуктивной инфекцией в клетках иммунной системы, что приводит к их функциональной недостаточности и формированию иммунодефицита как по клеточному, так и по гуморальному типу [Барин-ский И.Ф., 1982; ОЫ S., 1985; Rinaldo С, 1990; Самгин М.А., Халдин А.А., 2004].
Современная медицина не располагает методами лечения, позволяющими элиминировать вирус простого герпеса из организма человека. Целью лечения является лишь подавление его репродукции в период обострения, а также формирование и длительное сохранение адекватного иммунного ответа для блокирования реактивации вируса в очагах персистенции.
Выделяют три основных подхода в лечении герпетической инфекции: этиотропная терапия - применение противовирусных химиопре-паратов, патогенетическая иммунотерапия и комбинация этих методов. Одним из компонентов иммунотерапии являются достаточно широко применяемые препараты иммуноглобулинов. Однако целесообразность их назначения для лечения и профилактики герпесвирусной инфекции до настоящего времени остается дискуссионной.
Существовавшая ранее возможность позволяла охарактеризовать коммерческие препараты иммуноглобулинов по иммунологическим показателям по результатам иммуноферментного анализа. При этом в России применялись иммуноферментные тест-системы различных производителей, для конструирования которых использовались только лизатные антигены вируса простого герпеса первого и второго типов. В последние два года получены рекомбинантные поверхностные гликопротеины gD и
gG вируса простого герпеса первого и второго типов. Доказано, что им принадлежит основная роль в проникновении вируса в клетку и распространении инфекции jDubin G.H, Fishman О., 1992; Whitbeck J.C., Mug-gcridge M.I., 1999; Sanna P.P., Burton D. R., 2000]. Их использование при конструировании диагностических иммуноферментных тест-систем позволяет определять наличие, как в сыворотках больных, так и в препаратах иммуноглобулинов вируснейтрализующих анти-gD и анти-gG антител, с которыми может быть связана защитная функция гуморального звена иммунитета при герпетической инфекции. Эффективность препаратов иммуноглобулинов в терапии герпетической инфекции может зависеть от содержания в них антител к этим эпитопам вируса. Косвенным доказательством этого положения служит использование именно этих поверхностных гликопротеинов D и G для создания субъединичных гликопротеи-новых вакцин за рубежом, эффективность которых доказана [Morrison L.A., 2002; Koelle D.M., Corey L., 2003].
Для стандартизации иммунобиологических препаратов, унификации данных биологических и иммунологических тестов, делающих возможным единое обозначение специфической активности и сравнение количественных и метрологических характеристик в различных образцах Всемирная организация здравоохранения настоятельно рекомендует использование отраслевых стандартных образцов (ОСО).
На сегодняшний день в мире существует единственный стандарт ВОЗ противогерпетических антител против вируса Varicella-Zoster, разработанный Национальным институтом биологической стандартизации и контроля в Великобритании, охарактеризованный по биологической активности, 1 мл которого содержит 1 ME специфических антител против вируса Varicella-Zoster.
На антитела к другим вирусам герпеса из подсемейства альфа-герпесвирусов стандартного образца не существует.
Цель исследования Получение отраслевого стандартного образца вируснейтрализующих антител IgG класса против вируса простого герпеса первого и второго типов, его иммунологическая и биологическая характеристика
Задачи исследования
Анализ специфического гуморального иммунного ответа к разным структурным компонентам вируса простого герпеса первого и второго типов у больных в зависимости от частоты рецидивов и стадии инфекции.
Скрининг донорской плазмы на наличие антигликопротеиновых противогерпетических антител к антигенным эпитопам gD и gG вируса простого герпеса первого и второго типов.
3 Анализ коррелляционной зависимости между иммуноферментными
титрами образцов и защитными титрами вируснейтрализующих ан
тител на культуре клеток Vero В и на модели экспериментального
герпетического энцефалита.
4 Получение отраслевого стандартного образца вируснейтрализующих
антител против вируса простого герпеса первого и второго типов
(«ОСО IgG анти-ВПГ-1,2»), отвечающего требованиям ВОЗ, по им
мунологическим показателям и его биологическая стандартизация.
Научная новизна
Впервые получен российский отраслевой стандартный образец вируснейтрализующих антител против вируса простого герпеса первого и второго типов - «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» - регистрационный номер 42-28-377-05, отвечающий требованиям ВОЗ по признакам иммунологической стандартизации (линейности, параллельности, стабильности).
Впервые проведена биологическая стандартизация отраслевого стандартного образца противогерпетических антител IgG класса против вируса простого герпеса первого и второго типов и определена 1 единица вируснейтрализующей активности, который содержит 40 НЕ (нейтрализующих единиц) для вируса простого герпеса первого типа и 5 НЕ для вируса простого герпеса второго типа.
Установлены очень высокие (г >0,7), статистически значимые (р<0,05) корреляционные взаимосвязи между иммуноферментным титром антигликопротеиновых противогерпетических IgG антител анти-gD и gG и их вируснейтрализующей активностью в двух биологических системах: на культуре клеток Vera В и модели экспериментального герпетического энцефалита.
Научно-практическая значимость работы
Отраслевой стандартный образец «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» рекомендован для оценки содержания вируснейтрализующих антител в донорском сырье, в препаратах нормальных иммуноглобулинов, для получения специфического иммуноглобулина. Он может быть применен для оценки эффективности проводимой иммунотерапии противогерпетиче-скими вакцинами и препаратами иммуноглобулинов. Высокая степень корреляции между иммуноферментным титром анти-gD и анти-gG — антител с защитным эффектом в биологических тестах позволяет проводить контроль специфической активности коммерческих препаратов иммуноглобулинов только иммуноферментным методом с использованием тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ВПГ-1,2-лС» (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород).
Специфический иммуноглобулин с высоким содержанием вирус -нейтрализующих антител к эпитопам gD и gG вирусов простого герпеса может быть рекомендован для иммунотерапии больным с их дефицитом.
Получено свидетельство на отраслевой стандартный образец про-тивогерпетических антител ОСО 42-28-377-05, утверждена Инструкция по его применению ГИСК им. Л. А. Тарасевича от 26.04.05.
Оформлена нормативно-техническая документация: изменение к регламенту производства иммуноглобулина человека нормального для внутривенного введения, проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП) и Инструкция по применению препарата противогерпетического иммуноглобулина для внутривенного введения.
Оформлены две заявки на патентование: на «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» и «Препарат противогерпетического иммуноглобулина для внутривенного введения и способ его получения».
Внедрение результатов исследования в практику
В результате выполнения работы получена серия «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» (3000 ампул). «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» использован для контроля специфической активности пяти экспериментально-производственных серий специфического противогерпетического иммуноглобулина для внутривенного введения, которые прошли контроль в ОБТК («Иммуно-препарат»).
Основные положения, выносимые на защиту
Содержание в сыворотках больных хронической рецидивирующей герпетической инфекцией кожи антител (иммуноглобулинов G) к поверхностным гликопротеинам D и G является одним из ключевых моментов, определяющих частоту рецидивов.
Иммуноферментная тест-система нового поколения, определяющая антитела к гликопротеиновым эпитопам gD и gG является наиболее пригодной для отбора сырья и контроля специфической активности готовых препаратов иммуноглобулинов.
Разработанный отраслевой стандартный образец вируснейтрализую-щих антител против вируса простого герпеса первого и второго типов соответствует требованиям ВОЗ к стандартам антител по иммунологическим показателям.
Биологическая стандартизация отраслевого стандартного образца по содержанию антигликопротеиновых антител, выраженная в единицах нейтрализующей активности, позволяет определить защитный потенциал выпускаемых препаратов иммуноглобулинов.
Отраслевой стандартный образец вируснейтрализующих противо-герпетических антител может быть использован для оценки их содержания в донорском сырье, в препаратах нормальных иммуноглобулинов, для получения специфического иммуноглобулина.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены на научных конференциях: Ш конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы детской инфектологии. Инфекция и иммунитет» (Москва, 2004), Республиканской научной конференции «Применение иммунобиологических препаратов в практическом здравоохранении» (Уфа, 2004). Диссертация апробирована на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан (протокол № 33 от 26 мая 2005 года).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, оформлены две заявки на патентование. Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 115 страницах, содержит 18 таблиц и 7 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 146 источников (50 отечественных и 96 зарубежных).
