Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2
ОГЛАВЛЕНИЕ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
ЦИТОКИНОВАЯ СЕТЬ - УНИВЕРСАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ МЕЖДУ КЛЕТКАМИ 10
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПЛАЙСИНГ - СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ЦИТОКИНОВ ОЙ СЕТИ 14
МЕХАНИЗМЫ И СПОСОБЫ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА пре-мРНК 14
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПЛАЙСИНГ ЦИТОКИНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ 19
IL-4 - КЛЮЧЕВОЙ ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫИ ЦИТОКИН 31
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА IL-452 35
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 38
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 49
ДЕТЕКЦИЯ мРНК IL-4 ИIL-452 В МНК ПК ЧЕЛОВЕКА 49
ДЕТЕКЦИЯ мРНК IL-4 ИIL-452 В ЭРИТРОИДНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА 55
ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ 58
ЭФФЕКТЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ IL-4 ИIL-4S2 НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ МНК ПК ЧЕЛОВЕКА 62
ЭФФЕКТЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ IL-4 ИIL-462 НА ПРОДУКЦИЮ IgE И ЭКСПРЕССИЮ CD23 64
ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ IL-4 ИIL-452 НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ МНК В КУЛЬТУРЕ 66
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 71
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 80
ВЫВОДЫ 82
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 83
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Активное изучение генов и их продуктов, участвующих в функционировании цитокиновой регуляторной сети позволило к настоящему времени сформировать общие представления, характеризующие данную систему регуляции. Система цитокинов обладает такими свойствами, как универсальность, саморегуляция, полифункциональность и полиморфность [140].
В последние несколько лет обозначилось новое направление в исследованиях цитокинов, связанное с изучением изоформ как самих цитокинов, так и их рецепторов, образующихся при альтернативном сплайсинге транскриптов. Альтернативный сплайсинг как механизм формирования различных белковых продуктов одного гена без изменения его организации достаточно широко используется при экспрессии различных генов человека, и гены цитокиновой сети не являются исключением [14, 81, 115, 125, 176]. Альтернативный сплайсинг активно участвует в формировании полиморфизма системы цитокиновой регуляции, а сплайс-изоформы белков цитокинов и их рецепторов значительно расширяют регуляторные функции различных цитокинов, поскольку обладают свойствами отличными (или противоположными) от полноразмерных белков [14, 14, 87, 190]. Исследования в данном направлении могут серьезно дополнить современное представление о регуляции гемо- и иммунопоэза новыми сведениями о механизмах контроля эффекторных функций цитокинов, а также могут дать в руки клинических иммунологов специфические биологические препараты с новыми свойствами [14].
Сказанное выше в полной мере можно отнести к сплайс-варианту. IL-4 человека с делецией второго экзона - IL-452. Впервые делеционный сплайс-вариант мРНК гена IL-4 не содержащий последовательности 2
экзона и сохраняющий нормальную рамку считывания белка обнаружен в 1993 году [177]. Последующие исследования показали, что образование
мРНК IL-452 имеет тканеспецифический характер, а рекомбинантный
белок . проявляет себя как антагонист полноразмерного IL-4 в
экспериментах с иммунекомпетентными клетками [12, 15]. Установлено,
что мРНК IL-462 детектируется в различных типах иммунокомпетентных
клеток [105, 106]. Кроме того, имеются сведения, что в клетках тимуса и
бронхоальвеолярного лаважа наблюдается преобладание мРНК IL-452 над
* мРНК IL-4, в сравнении с мононуклеарными клетками периферической
крови [9, 15]. Наличие сплайс-вариантов IL-4 в других типах клеток пока
не изучено, однако в ряде работ сообщается об обнаружении дельта-
формы мРНК гена IL-4 в образцах тканей миндалевидной железы, легких,
кишечника, тимуса и в тканях плаценты и амниохориона [16, 49, 106]. При
изучении экспрессии гена IL-4 у пациентов с некоторыми патологиями
% также обнаружено изменение в уровнях полноразмерной - IL-4 и
альтернативной - IL-452 форм мРНК [17, 74, 120, 158].
В работах [12, 15] были исследованы эффекты рекомбинантных белков IL-4 и IL-452, оказываемые на различные типы иммунокомпетентных клеток и установлено, что IL-452 проявляет
-. свойства естественного антагониста IL-4 и отменяет его действие на
функции Т-клеток, В-клеток и моноцитов. Предполагаемый механизм действия сплайс-варианта - конкурентное, блокирование рецептора IL-4 без активации сигнальных путей, что было подтверждено при моделировании пространственной структуры белка . IL-452 и белков образующих рецепторные комплексы IL-4 [204]. Однако фибробласты в равной степени отвечают как на IL-4, так и на IL-452, что свидетельствует о возможной активации рецепторов дельта-формой на этом типе клеток [17].
Таким образом, в отношении экспрессии сплайс-вариантов гена IL-4 и биологических свойств белка IL-452 остается достаточно много не
^ изученных вопросов, ответы на которые позволят определить функции и
значимость сплайс-варианта IL-452 в регуляторных реакциях, определяемых геном IL-4. Эти вопросы связанны с детекцией сплайс-варианта IL-4 в нелимфоидных клетках и способностью IL-452 к активации клеток через различные типы рецепторов IL-4. Кинетика изменения уровня полноразмерной и альтернативной форм мРНК IL-4
щ также требует изучения.
В этой связи представлялось актуальным в данной работе прояснить некоторые моменты экспрессии сплайс-вариантов гена IL-4 в различных клетках и более полно охарактеризовать биологическую активность рекомбинантного белка IL-462.
? ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Цель работы: Изучить экспрессию сплайс-вариантов мРНК гена IL-4 в мононуклеарных клетках периферической крови и в эритроидных клетках человека и охарактеризовать биологическую активность рекомбинантного белка IL-452 культуре мононуклеарных клеток.
Задачи исследования:
Охарактеризовать динамику изменения уровня мРНК IL-4 и IL-452 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека.
Определить наличие слайс-вариантов мРНК гена IL-4 в эритроидных клетках человека.
Изучить влияние рекомбинантных белков IL-4 и IL-452 на пролиферативную активность мононуклеарных клеток человека.
Определить эффекты рекомбинантных белков IL-4 и IL-452 на синтез IgE и экспрессию CD23 В-клеткам и в культуре мононуклеарных клеток человека.
5. Охарактеризовать эффекты рекомбинантного IL-482 на продукцию
цитокинов мононуклеарнымн клетками человека в культуре.
%Л 6. Исследовать, полученные рекомбинантные белки IL-4 и IL-462 на
наличие специфической биологической активности.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Впервые показано, что альтернативный сплайсинг гена IL-4
происходит не только в иммунокомпетентных клетках, но и в эритроидных
4 ядросодержащих клетках фетальной печени и костного мозга человека.
Продемонстрировано, что в стимулированных митогеном
мононуклеарных клетках человека определяются две формы мРНК гена
IL-4, причем пик уровня мРНК IL-462 наблюдается на 3 часа, а пик мРНК
IL-4 на 6 часов, что определяет изменение в соотношении сплайс-форм при
активации клеток.
^ Впервые установлено, что rhIL-452 может выступать в роли
антагониста и синергиста полноразмерной формы IL-4 в различных иммунологических реакциях мононуклеарных клеток периферической крови in vitro. В частности, rhIL-452 выступает как антагонист и ингибирует стимулирующее действие rhIL-4 на пролиферацию МНК и синтез IgE. В качестве агониста rhIL-452 выступает при активации экспрессии CD23 на поверхности В-клеток и при регуляции экспрессии IL-4 в культуре МНК ПК человека, где его стимулирующий эффект аналогичен действию rhIL-4. Эффект оказываемый rhIL-452 на продукцию IL-6 мононуклеарнымн клетками прямо противоположен ингибирующему действию полноразмерного белка rhIL-4.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Получены новые сведения об экспрессии IL-452 и его биологических эффектах, дополняющие картину функционального значения
альтернативного сплайсинга пре-мРНК гена IL-4 в регуляторных функциях системы цитокинов.
Показано, что альтернативный сплайсинг пре-мРНК имеет место при экспрессии гена IL-4 в эритроидных ядросодержащих клетках, что свидетельствует о возможном участии сплайс-варианта IL-4S2 в регуляции гемопоэза.
Наличие у рекомбинантного белка IL-452 человека свойств антагониста и агониста, указывает на способность этого белка к трансдукции специфического сигнала.
В результате исследования получены и охарактеризованы рекомбинантные белки IL-4 и IL-452 человека, обладающие специфической активностью, которые могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов их действия на клетки-мишени и в перспективе для диагностики и иммунотерапии.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
Ген IL-4 в мононуклеарных клетках периферической крови и эритроидных клетках человека экспрессируется с участием альтернативного сплайсинга.
IL-452 способен как стимулировать, так и ингибировать влияние IL-4 и обладает собственными эффектами на мононуклеарные клетки периферической крови человека.
АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003г.), 2) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003 г.), 3) объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004г.), 4) 8-ом всероссийского научном форуме с
международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г.).
САМОСТОЯТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕННОЙ РАБОТЫ.
Создание генетических конструкций и модификация бактериальных
клеток (Е. соН) проводилась сотрудниками группы фармакогеномики НИИ ХБиФМ СО РАН, г. Новосибирск (руководитель к.б.н. М.Л. Филипенко). Получение и очистка рекомбинантных белков проводилась сотрудниками ООО «Центр инженерной иммунологии» г. Новосибирск (руководитель Н.М. Пусто шилова).
Цитофлюориметрический анализ проводился на базе лаборатории клинической иммунологии НИИ КИ СО РАМН (зав. лаборатории д.м.н. B.C. Кожевников).
Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИ КИ СО РАМН.
Автор выражает благодарность Л.Р. Птицыну (ГНЦ РФ ГосНИИ «Генетика», г. Москва) за любезно предоставленный для исследований препарат рекомбинантного белка IL-462.
Большую признательность автор выражает научному руководителю работы профессору, д.м.н. СВ. Сенникову за подробное конструктивное обсуждение полученных результатов, а также всем сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии за благожелательное отношение в ходе выполнения работы.
![Клинико-иммунологическая характеристика больных ревматоидным артритом при различных аллельных вариантах генов ФНО-[А] (-308) и ИЛ-1[В] (+3953)](/i/i/4321/312305.png "Клинико-иммунологическая характеристика больных ревматоидным артритом при различных аллельных вариантах генов ФНО-[А] (-308) и ИЛ-1[В] (+3953) Герцог Оксана Александровна")
