Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. Обзор литературы 11-31
Определение апоптоза и механизмы реализации апоптотической программы 11
Роль апоптоза в опухолевом росте и
реализации противоопухолевого эффекта химиотерапии 16
1.3 Способы оценки индуцированного и спонтанного
апоптоза в клеточных популяциях 19
ГЛАВА II. Материалы и методы 31-45
ГЛАВА III. МТТ-анализ в оценке чувствительности
клеток к индуцированному апоптозу 45-85
III. 1 Методика оценки полученных данных 45
Ш.2 Результаты использования модели индуцированного
апоптоза для тестирования эффективности химиотерапии
и оценки биологических характеристик клеток опухоли 47
III.З МТТ-анализ в тестировании модулирующей
апоптоз активности новых лекарственных соединений 79
ГЛАВА IV. ДНК-анализ методом проточной
цитофлюориметрии в оценке спонтанного и
индуцированного апоптоза 85-104
IV. 1 Сравнительная оценка различных
методов цитофлюориметрического анализа уровня
и характера апоптоза клеток крови 85
IV.2 Апоптоз клеток крови в оценке отсроченного
миелосупрессивного эффекта полихимиотерапии 88
IV.3 Спонтанный апоптоз лейкемических клеток
в прогнозе эффективности индукционной терапии ОЛЛ 93
IV.4 Влияние новых лекарственных соединений (синтнтических тимических пептидов) на апоптоз
клеток крови 99
ГЛАВА V. Кинетика апоптоза в оценке биологических
свойств клеток 104-113
V.1 Оригинальный метод оценки кинетики апоптоза
клеток крови 102
V.2 Кинетика апоптоза лейкоцитов периферической крови у здоровых людей и в длительной ремиссии ОЛЛ... 104 V.3 Кинетика апоптоза лейкемических клеток в прогнозе их чувствительности к химиопрепаратам и
эффективности терапии 107
ГЛАВА VI. Фармакоэкономический расчет использования апоптотических клеточных моделей... 113-118 ГЛАВА VII. Перспективы и ограничения в использовании апоптотических клеточных моделей для оценки состояния кроветворения и
биологических свойств клеток 118-128.
ВЫВОДЫ 129-130
ПРАКТИЧЕСКИЕ РКОМЕНДАЦИИ 131
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 132
Введение к работе
Клетки крови и кроветворных органов являются легко доступным объектом для изучения как в норме, так и при различных патологических процессах в организме человека (23). Любые соматические клетки, в том числе и клетки крови, несут в себе исчерпывающую информацию о геномике данного субъекта и связанных с этим особенностях его метаболизма; межклеточных и межорганных связях, характерных для каждой ткани; нарушениях, лежащих в основе развившейся патологии. В то же время на клеточных моделях можно изучать действие различных лекарственных препаратов и активно действующих биологических средств, оценивая как механизм их действия, так и индивидуальную чувствительность к ним клеток данного индивидуума. Многие исследования такого рода проводятся на клеточных линиях, выращенных из различных тканей человека и животных вне организма. Преимущество таких моделей заключается в их высокой клеточности и возможности проведения большого объема параллельных и контрольных исследований на идентичном материале. Однако длительное культивирование клеток вне организма часто сопряжено с их вирусным загрязнением, перестройками генома, и предоставляя уникальные возможности для фундаментальных исследований, не дает ответа об особенностях патологии у конкретного больного, а также индивидуальной чувствительности клеток к тем или иным внешним воздействиям (268,185). Естественно, данные, полученные на изолированных клетках вне организма, не могут быть безоговорочно перенесены на их состояние в целостном организме, точно так же, как чувствительность ex vivo микроорганизмов к антибиотикам не всегда в полном объеме отражает ответ больного на эту терапию.
Однако и те, и другие модели являются ценнейшим инструментом современной медицины.
Анализ воздействия лекарственных препаратов на изолированные из организма клетки ex vivo может быть дополнен сравнением изучаемых свойств клеток, выделенных из организма до и в различные сроки после проведенного лечения.
Кроветворение относится к тканям с быстрым клеточным самообновлением. Клеточное равновесие обеспечивается, как известно, основным закон кинетики: в единицу времени рождается и умирает одно и то же количество клеток (10). В основе развития болезней крови лежат те или иные нарушения закона кинетического клеточного равновесия (35,192,247,254). Рождение клеток связано с пролиферацией стволовых клеток, клеток-предшественников и делящихся миелоидных клеток. Эти процессы легко могут быть оценены ex vivo в культуральных моделях, их исследования активно проводились в гематологии, иммунологии и онкологии в течение прошлого века. Относительно недавно (не более двух десятилетий назад) внимание исследователей было сфокусировано на другом полюсе жизненного цикла клеток - клеточной смерти. Было показано, что все соматические клетки обладают генетически детерминированным механизмом клеточной смерти - апоптозом, разрабатываются клеточные модели для его изучения (42,54,55,61,62,79,113,250).
Таким образом, жизнью клетки управляют две ведущие программы - программа жизни (пролиферация) и программа умирания (апоптоз). Нарушения, возникающие в динамическом равновесии процессов продукции и гибели клеток, лежат в основе развития многих, в том числе онкологических и гематологических заболеваний, сопровождающихся как дегенеративными, так и
пролиферативными изменениями, коррекция этого равновесия является основным направлением современной патогенетической терапии многих болезней, в том числе и болезней крови (296,305,300,278).
Ингибирование клеточной гибели происходит при опухолевых поражениях различной этиологии, аутоиммунных, вирусных заболеваниях, а усиление апоптоза - при ВИЧ-инфекции, миелодиспластических и нейродегенеративных заболеваниях, химиотерапии (10).
6. Токсические поражения печени
Широкое распространение и социальная значимость заболеваний, в патогенезе которых нарушения программы апоптоза клеток играют ведущую роль, делают актуальным исследование и мониторинг состояния апоптотического звена гомеостаза у таких пациентов, а также создание тестовых моделей для определения уровня апоптотической активности клеток субстрата болезни для правильной тактики и оценке эффективности проводимой терапии.
Разработка клеточных моделей, позволяющих изучать апоптоз
клеток крови вне организма и влияние на эти процессы
лекарственных препаратов и биологически активных средств
представляется весьма актуальной для индивидуального подбора
оптимальной терапии и контроля лечения при опухолевых
заболеваниях, а также для изучения эффективности и характера
воздействия новых препаратов на клетки крови человека. При
существующем многообразии моделей изучения клеток крови ех
vivo существуют сложности в оценке клинического значения
получаемых результатов. Поэтому целью настоящего
исследования явился сравнительный анализ различных клеточных
моделей изучения апоптоза для разработки оптимальных
моделей изучения индуцированного и спонтанного апоптоза клеток крови. Исходя из цели исследования были поставлены следующие задачи:
1. Выбрать оптимальные модели для оценки интенсивности и характера действия лекарственных препаратов и биологически активных веществ на клетки крови человека.
Разработать оптимальные способы оценки получаемых результатов.
Оценить клиническое значение результатов использования клеточных моделей изучения апоптоза ex vivo.
Провести сравнительный фармакоэкономический анализ различных клеточных моделей изучения апоптоза.
Новизна исследования состоит в том, что впервые было
установлено, что клеточные модели изучения апоптоза
предоставляют возможности как для оценки профиля
чвствительности тестируемых клеток к определенному набору
препаратов, так и для сравнения степени чувствительности
различных популяций клеток к проапоптотическим факторам. Также
впервые был установлен модулирующий эффект тимических
пептидов: не оказывая самостоятельного цитотоксического
воздействия на популяцию опухолевых клеток, они способствовали
избирательному усилению проапоптотического действия
химиотерапии. Впервые было продемонстрировано, что различная
способность спонтанному и индуцированному апоптозу является
биологической характеристикой опухолевых клеток и определяет их
чувствительность к проводимой химиотерапии. Разработан
оригинальный метод балльной оценки чувствительности клеток к
проапоптотическому действию различных препаратов,
позволяющий сравнивать действие препаратов с различной фармакологической активностью. Разработан новый метод тестирования состояния апоптотической программы в клетках -оценка кинетики спонтанного апоптоза и показано его значение в оценке биологических свойств клетки.
Научное значение представляет то, что апоптоз, являясь генетически детерминированной программой, характеризующей
основные биологические свойства клетки, может служить чувствительной тест-системой для выявления и оценки разнообразных внешних воздействий и влияния внутренних факторов на состояние клеточных популяций. Апоптотическая программа клетки длительно хранит память об испытанных воздействиях. Так было установлено, что в основе отсроченного миелосупрессивного эффекта химиотерапии (значительное снижение клеток-предшественников гемопоэза при сохранности клеточного состава периферической крови и костного мозга в ремиссии онкогематологических заболеваний) лежит повышение способности клеток крови к спонтанному апоптозу. Обнаруженные корреляции между способностью клеток к спонтанному и индуцированному апоптозу позволяют считать, что в основе чувствительности опухолевых клеток к проапоптотическому действию химиопрепаратов лежит сохранность генетически детерминированной апоптотической программы.
Практическое значение результатов исследования заключается в том, что даны методические разработки основных клеточных моделей для изучения проапоптотического действия различных препаратов на клетки крови. Разработаны рекомендации по выбору клеточных моделей и способу их оценки в зависимости от целей исследования. Разработаны клеточные модели для доклинического испытания новых лекарственных препаратов. Дан экономический расчет стоимости исследований на предлагаемых клеточных моделях.
Положения, выносимые на защиту: 1. Клеточная модель индуцированного апоптоза в МТТ-тесте адекватна для сравнительной оценки эффективности циторедуктивного действия противоопухолевых препаратов и
определения спектра чувствительности к ним различных клеточных популяций.
Клеточные модели изучения спонтанного апоптоза дают важную информацию о биологических свойствах клеток, имеющих клиническое и прогностическое значение.
Анализ кинетики апоптоза клеточных популяций важен для оценки сохранности генетически детерминированной программы клеточного самоубийства.
Модели анализа апоптоза клеточных популяций ex vivo могут использоваться для оценки эффективности и расшифровки механизма действия новых лекарственных соединений.
![Состав и функциональные особенности прилипающей фракции пуповинной крови человека [Электронный ресурс]](/i/i/4250/195028.png "Состав и функциональные особенности прилипающей фракции пуповинной крови человека [Электронный ресурс] Бархатов Ильдар Мунерович")
