Состав и функциональные особенности прилипающей фракции пуповинной крови человека [Электронный ресурс] Бархатов Ильдар Мунерович

Содержание к диссертации

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .. 8

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ... 32

1. Характеристика исследуемого материала 32

2. Методы исследования 32

2.2.1. Методы получения материала исследования 32

2. Метод выделения мононуклеарной фракции пуповинной крови на градиенте плотности 32

3. Культивирование прилипающей фракции пуповинной крови... 33

4. Иммунофенотипирование методом проточной цитофлюорометрии 34

5. Методы клоногенного культивирования клеток-предшественников гемопоэза 35

6. Культуральное исследование в метилцеллюлозе 37

7. Индукция дифференцировки мезенхимальных предшественников 38

2.2.8 Статистическая обработка данных 38

ГЛАВА 3. МОНОСЛОЙНАЯ КУЛЬТУРА ПУПОВИННОЙ КРОВИ 39

1. Морфология прилипающей фракции монослойнои культуры пуповинной крови 39

2. Фенотип прилипающей фракции монослойнои культуры

пуповинной крови 42

3.2.1 Влияние сроков культивирования на фенотипический состав монослойнои
культуры 42

3.2.2 Влияние пассирования на фенотипический состав

монослойной культуры 54

ГЛАВА 4.СВЯЗБ СОСТАВА МОНОСЛОЙНОЙ КУЛЬТУРЫ ПУПОВИННОИ
КРОВИ С ФЕНОТИПИЧЕСКИМ СОСТАВОМ МОНОНУКЛЕАРНОИ ФРАКЦИИ
ПУПОВИННОИ КРОВИ 57

ГЛАВА 5. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МОНОСЛОЙНОЙ
КУЛЬТУРЫ ПУПОВИННОИ КРОВИ 63

1. Дифференцировочные потенции клеток прилипающей фракции монослойной культуры ПК 63

2. Оценка способности клеток монослойной культуры к клональному

росту в метилцеллюлозе 64

5.3 Гемостимулирующие свойства монослойной культуры пуповиннои крови 64

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 72

ВЫВОДЫ 95

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 96

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 97

Введение к работе

В трансплантологии все большее место занимает пересадка мезенхимальных стволовых клеток (MGK) [28,125,172], основным источником которых до последнего времени являлся костный мозг [10,14]. Направления этой терапии связаны со свойствами МСК поддерживать кроветворение при котрансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) [67,76,188]; подавлять иммунные конфликты при аллогенной, особенно неродственной трансплантации [132]; замещать и восстановливать функции поврежденных негемопоэтических тканей (кости, хряща, скелетных мышц, сердечной мышцы, нервной ткани, печени и др.) [24,191,252]. Преимущества МСК в клеточной терапии определяются их иммуномодулирующими способностями, иммунотолерантностью при аллогенной трансплантации и возможностью наработки больших количеств в относительно несложных условиях культвирования [12]. Альтернативными источниками МСК, кроме костного мозга, являются жировая ткань [235], пуповинная кровь, пупочный канатик [199], плацента [30,100] и амниотическая жидкость [101]. Пуповинная кровь (ПК) представляет особый интерес ввиду ее доступности, относительной легкости получения и безопасности для потенциального донора [78]. Как показали многочисленные исследования [32,63,.82,135], МСК могут содержаться в прилипающей клеточной фракции пуповинной крови, требующей культивирования для наработки необходимых для трансплантации количеств МСК. Однако в тоже время имеется ряд публикаций, опровергающий данный факт [150,242], до сих пор остаются неразработанными условия препаративной подготовки и культивирования прилипающей фракции пуповинной крови. Отсутствует четкое представление о клеточном составе, функции первичной культуры прилипающей фракции и ее связи с клеточным составом пуповинной крови. Отдельного внимания заслуживают и эндотелиальные предшественники, недавно обнаруженные в пуповинной крови [116,182,185], обладающие уникальной способностью к постнатальному неоангиогенезу.

Именно поэтому настоящее исследование, посвященное изучению состава и функции первичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови, представляется высоко актуальным.

Целью настоящей работы явилась стандартизация условий препаративной подготовки, культивирования и оценка клеточного состава; первичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови.

Для достижения этойцели были поставлены следующие задачи:

1. Отработать метод культивирования монослойной культуры пуповинной крови (МКПК) доношенных новорожденных.

2. Разработать критерии стандартной оценки первичной культуры» прилипающей фракции пуповинной крови.

Зі Оценить влияние на состав МКПК временных параметров заготовки и

хранения образца ПК. 4. Выявить наличие и характер связи между фенотипическим составом

мононуклеарной фракции пуповинной крови (МФПК) и ее

монослойной культуры. 5; Охарактеризовать дифференцировочные потенции МСК-подобных

клеток МКПК.
6. Создать культуралБную модель для характеристики

гемостимулирующей функции МКПК и оценить

колониестимулирующую активность последней.

Научная новизна

Впервые разработан метод структурного анализа первичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови, основанный на определении соотношения основных клеточных популяций по характерному фенотипу. Отработана оригинальная культуральная модель для характеристики гемостимулирующей функции МКПК и оценки ее колониестимулирующей активности. Впервые было показано, что прилипающая фракция первичной монослойной культуры оказывает стимулирующее влияние на колониеобразование гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, по характеру и силе воздействия близкое к таковому стандартного фидера. При этом существенное влияние на их пролиферативную активность оказывают клеточные элементы с маркерами MGK (GD90⁺GD31~). Научной новизной характеризуются результаты

сравнения клеточного состава МКПК и МФПК, показавшие, что культивирование прилипающей фракции пуповинной крови увеличивает долю ранних кроветворных предшественников (CD34⁺HLADR") за счет уменьшения доли более зрелых (CD34⁺CD45⁺), при этом отмечается также и увеличение доли эндотелиальных предшественников (CD34⁺CD45" и CD45~CD31⁺).

Научное значение имеют полученные в работе данные о структуре первичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови, изменении ее при различных сроках культивирования и в первом пассаже. Было выявлено, что на фоне длительного культивирования большая часть гемопоэтических клеток элиминируется из культуры и не способна к повторной адгезии. В то же время среди негемопоэтической популяции наблюдается обратное - МСК и эндотелиальные предшественники способны к экспансии в исследованных культуральных условиях, а последовательное пассирование способствует увеличению их концентрации в культуре. Получены важные научные данные о способности МСК монослойной культуры дифференцироваться в адипоциты и остеобласты, подтверждающие функциональную полноценность этих клеток.

Научно-практическое значение заключается в разработке оптимального метода культивирования прилипающей фракции пуповинной крови и референтных показателей клеточного состава популяции, характеризующих первичную культуру этих клеток. Особое практическое значение имеет изучение влияния на состав и функцию первичной культуры сроков и способов препаративной подготовки. Показано, что на фоне увеличения временных параметров забора и хранения образцов ПК снижается концентрация в монослойной культуре МСК-подобных клеток и гемопоэтических клеток, что в свою очередь снижает гемостимулирующую способность МКПК. С целью оптимизации изоляции и последующей экспансии негемопоэтической фракции МКПК показано предварительное выделение мононуклеарной фракции ПК на градиенте плотности.

Работа выполнена в лаборатории регуляции кроветворения (заведующая - д.б.н. Осипова Е.Ю.) отдела молекулярной гематологии (руководитель - к.м.н. Румянцев С.А.) Федерального научно-клинического центра гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава (директор - член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор Румянцев А.Г.)

Похожие диссертации на Состав и функциональные особенности прилипающей фракции пуповинной крови человека [Электронный ресурс]

Растворимые комплексы антигенов адгезии в сыворотке крови человекаБабаев Алексей Александрович

Изучение механизма взаимодействия иммуномодулятора полиоксидония с клетками иммунной системы периферической крови человека in vitroДьяконова Вера Анатольевна

Механизмы фармакологической регуляции процессов активации и гибели лимфоцитов периферической крови человекаШмарина, Галина Васильевна

Клеточные модели оценки уровня и характера апоптоза клеток крови человекаОсипова Елена Юрьевна

Комплексы альфа-2-макроглобулина с иммуноглобулином G и другими белками крови человека в норме и при патологииЗорина Вероника Николаевна

Оптимизация промышленного производства анти-А и анти-В моноклональных антител для определения групп крови человека системы АВ0Проскурина, Наталья Владимировна

Моделирование свойств CD133#2+#1 гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человекаИпатов Сергей Евгеньевич

Лечебно-профилактические и диагностические препараты крови человека на основе безотходной технологииАлешкин, Владимир Андрианович

Изменение состояния красной крови человека под влиянием невесомостиЛегеньков, Владимир Иванович

Фотометрический НСТ-тест с нейтрофилами крови человека и его клинико-иммунологическая значимость у больных с травмой опорно-двигательного аппаратаЗинкин Владимир Юрьевич