Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИИ 3
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
Дифференцировочные антигены клеток иммунной системы 8
Антигены адгезии 12
Семейство интеїринов 19
Суперсемейсіво иммуноглобулинов 27
1.3. Растворимые формы мембранных антигенов 36
1.3.1. Распюримые формы ІСАМ-1 и ІСАМ-3 38
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 45
Используемые моноклональныеашит ел а 46
Реакция непрямой иммунофлуоресценции 47
Получение козьих поликлональных антител, специфичных к
поверхностным антигенам мононуклеарных клеток крови человека...48
Перйодатный метод синтеза коньюгаїа 49
Иммуноферментные методы определения растворимых форм мембранных белков клеток иммунной сисіемьі 49
Методы статистического анализа 51
3. РЕЗУЛЬГАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕ11ИЕ 52
Растворимая форма CD50 антигена 52
Растворимая форма суммарного и олигомерного CD54 антигена 72
Растворимая форма CD18 антигена 86
Разработка иммунофермешных методов определения расіворимьіх
комплексов CD 18-CD54 и CD18-CD50 104
3.5. Растворимые комплексы молекул адіезии CD18-CD54 и CD18-CD50 115
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 135
ВЫВОДЫ 139
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА 140
Введение к работе
Актуальность проблемы
Белки адгезии играют важную роль во многих биологических процессах, таких как эмбриогенез, гемостаз и воспаление. Основная их функция состоит в поддержании межклеточных взаимодействий и взаимодействий между клетками и зкстраклеїочным маїриксом. Подобные контакты обеспечивают передачу сигналов, регулирующих функции струкіурньїх компонентов цитоскелета, учасівующих в процессе активации клетки. Благодаря своим цитоплашатическим доменам адгезивные молекулы воспринимают внутриклеточные сигналы, которые регулируют экспрессию, распределение по клеточной мембране (спрейдинг) и функциональную активность поверхностных рецепторов (Aplin et al., 1998). К антигенам адгезии oiносят большую группу интегринов, являющихся геїеродимерами. Наиболее важную роль в иммунных реакциях играет семейство р2-интегринов и иммуноглобулиноподобные белки семейства ІСАМ. Так, в формировании иммунологического синапса участвуют рУинтегрин, называемый LFA-1, и белок адгезии ІСАМ-1 (Bromley et al., 2001). В инициации первичного иммунного ответа принимает участие антиген адгезии ICAM-3, взаимодействующий на дендритных клетках с DC-SIGN, а іакже с LFA-1 (CD1 la/CD 18) (van der Vieren et al., 1995; Bleijs et al., 2001).
Многие молекулы адгезии существуют не только в мембранной, но и в растворимой форме. Растворимые антшены адгезии могу і находиться как в мономерной, так и в олигомерной форме, они сохраняют способность взаи-модейсівовать со своими мембранными партерами, принимают участие в регуляции иммунных реакций (Новиков и др., 2006; Jun et al., 2001). Их содержание в биологических жидкостях способно меняться при вирусных гепатитах, ВИЧ-инфекции, ожоговой паюлогии, аутоиммунных и онкологических заболеваниях (Евсешеева и др., 2005; Horiike et al., 1994; Blann et al., 2002). Концентрация растворимых молекул адіеши в сьівороіке крови может вы-
ступать как показатель тяжести течения и прогноза некоторых заболеваний (Лебедев, 2003; Kuang et al., 2002).
Цель исследования
На основе существующих предпосылок изучить возможность наличия в крови человека расіворимьіх комплексов, состоящих и* р2-интегринов и молекул адгеши семейсіва ІСАМ, и оценить влияние патологических состояний на их сывороточный уровень.
Задачи
Оценить сывороточный уровень растворимого CD50 антигена при вирусных іепатитах А, В, С, ожоювой травме, раке молочной железы.
Определить относительное содержание в сыворотке крови суммарной и олшомерной фракций растворимого CD54 антигена при указанных заболеваниях.
Разработать иммунофермеигный метод детекции растворимой формы CD 18 антигена.
Определить сывороточный уровень растворимой формы CD 18 антигена в крови здоровых доноров и больных вирусными гепатитами, раком молочной железы, ожої овых больных.
Разрабоїать иммуноферментные методы детекции растворимых комплексов CD18-CD54 и CD18-CD50 в крови человека и определить их сывороточное содержание у здоровых доноров.
Оценить сывороючный уровень растворимых ассоциатов CD18-CD54 и CD18-CD50 при вирусных гепаїиіах А, В, С, ожоговой іравме, раке молочной железы.
Положения, выносимые па защиту
1. В крови человека присутствуют растворимая форма CD 18 антигена и растворимые комплексы CD18-CD54 и CD18-CD50.
Сывороточный уровень олигомерного sCD54 антигена увеличивается при вирусных гепатитах А и С; концентрация sCD18 антигена повышается при гепатите А и снижается при раке молочной железы. Содержание растворимых ассоциатов CD18-CD54 увеличивается при гепатите С и снижается при раке молочной железы.
Выявлены изменения сывороточного содержания sCD18, sCD50 антигенов, а также относительного количесіва CD18+ и CD50+ мононуклеар-ных клеток крови при ожоговой болезни.
Научная новизна
Выявлены изменения сывороточного уровня растворимого CD50 (sCD50) антигена, а также относительною содержания СО50-положительных (CD50T) мононуклеарных клегок у больных с ожоговой травмой различной площади поверхности і ела на протяжении всего периода течения ожоговой болезни.
Показано повышение сывороточного уровня суммарной фракции растворимого CD54 (sCD54) антиіена у больных вирусным гепатитом С, не имеющих анштел kNS3 или NS4 белкам или имеющих IgM к соге-антигену. При вирусных іепагитах А и С, ожоговой болезни обнаружено увеличение сывороточного уровня олигомерной фракции sCD54 антигена.
Продемонстрировано наличие расіворимой формы CD18 (sCD18) антигена в крови человека. Сывороточный уровень sCD18 антигена увеличивался при вирусном гепатите А, снижался при раке молочной железы. Выявлены изменения в сывороточном уровне sCD18 антигена, а также в относительном содержании С018-положительных (CD18+) мононуклеарных клеток периферической крови, сохранявшиеся на протяжении всего периода ожоговой болезни.
В крови человека впервые обнаружены растворимые ассоциаты антигенов CD 18 и CD54, а также антигенов CD 18 и CD50. Определена их сывороточная концентрация в крови здоровых доноров. У больных вирусным гепа-
титом В с высоким титром HBs-ашигена наблюдалось снижение уровня растворимых комплексов CD18-CD54, а с более низким титром HBs-антигена -повышение сывороточного содержания растворимых комплексов CD 18-CD50. Показано, что концентрация комплексов CD18-CD54 возрастала в крови больных вирусным гепатитом С, не имеющих антител к NS3 или NS5 антигенам. У больных гепатитом С, в крови когорых были выявлены IgM к core-белку, повышался сывороточный уровень растворимых комплексов CD18-CD54 и CD18-CD50. При раке молочной железы содержание растворимых комплексов CD18-CD54 снижалось.
Практическая значимость работы
С использованием моноклональных и поликлональных антител разработаны иммунофермеигные методы определения растворимою антигена CD 18, а также растворимых комплексов CD18-CD54 и CD18-CD50 в сыво-роїке крови. Методы применимы при изучении участия этих белков в молекулярных механизмах иммунных реакций. Результаты могут бьпь использованы для оценки состояния иммунитета, являться основой для разработки современных методов мониторинга иммуноопосредованных заболеваний, создания новых подходов к оценке эффективности вакцинопрофилактики социально значимых инфекций. Данные включены в программу курса по иммунологии для студентов ВУЗов медицинского и биологического профиля.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась 14 сентября 2006 года на расширенном совмесшом заседании кафедры молекулярной биологии и иммунологии Нижегородскою госуниверсиїета им. Н.И. Лобачевского и Нижегородского отделения Российского научного общееіва иммунологов с участием сотрудников НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной.
Результаты работы представлены на Международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2003), VIII, IX и XI Нижегородских
сессиях молодых ученых (Нижний Новгород, 2003, 2004, 2006), 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004), II Всероссийском симпозиуме «Тест-методы химического анализа» (Сараюв, 2004), научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», посвященной 85-летию со дня рождения академика РЛМН И.Н. Блохиной (Нижний Новюрод, 2006).
По теме диссертации опубликовано 13 печаїньїх работ.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа в объеме 162 листов состой і из введения, об-юра литературы, описания материалов и меюдов исследований, собственных результаюв и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 42 рисунками и 9 таблицами. Библиографический указатель включает 203 исючника литературы (35 отечественных и 168 иностранных).
