Содержание к диссертации
Список используемых сокращений: 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Структура и функции ядрышка 10
Реакции клетки и ядрышка на стрессовые воздействия 19
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 30
Клетки 30
Антитела 31
Воздействие ингибиторов 33
Методы исследования 33
Реакция непрямой иммунофлуоресценции 33
Выявление фрагментации ДНК методом TUNEL 35
Мечение клеток BrdU 36
Выявление аргентофильных белков 37
Выявление микрофиламентов 37
Обработка РНКазой А и пепсином 38
Иммуноблотинг 38
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 41
3.1. Основная характеристика антигена, выявляемого новым
моноклональным антителом A3 41
Оптимизация условий выявления A3 антигена 41
Определение видовой специфичности МКА A3 44
Локализация антигена A3 в интерфазных и митотических клетках 45
Особенности распределения антигена A3 в ядрышках клеток различных культур 46
3.2. Реакция A3 антигена на действие ингибиторов белкового
СИНТеЗа^ »......»„...^.»...........»». »>^»^r.!a.V."!!La!^^^i"Z'"."l>JS
3.2.1. Влияние ингибитора белкового синтеза - анизомицина на локализацию A3
антигена в клетках различного тканевого происхождения 56
3.2.2. Влияние различных ингибиторов белкового синтеза на локализацию A3
антигена в клетках HeLa 60
?
3.2.3. Реакция клеток на ингибирование белкового синтеза в зависимости от
стадии клеточного цикла 61
Выявление Ag-белков после действия анизомицина 62
Выявление фрагментации хроматина методом TUNEL 63
Структура актинового цитоскелета в клетках HeLa, обработанных
анизомицином 65
3.2.7. Колокализация A3 с другими ядрышковыми белками после инкубации с
анизомицином 67
3.3. Выявление аномальной локализации A3 антигена при
длительном культивировании клеток HeLa 73
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 78
ВЫВОДЫ: 86
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 87
Список используемых сокращений:
р ДНК - рибосомная ДНК
рРНК - рибосомная РНК
мРНК - матричная РНК
ФГА - фитогемагглютинин
ЯОР - ядрышкообразующий район
Ag-ЯОР - аргентофильный ядрышкообразующий район
РНК Пол I - РНК Полимераза I
РНК Пол II - РНК Полимераза II
МКА - Моноклональное антитело
мяк РНК - малая ядрышковая РНК
ЯК- ядрышко
UBF - Upstream Binding Factor
ер - core promoter (промотор)
UCE - upstream control element
NoppHO - Nucleolar phosphoprotein 140 kDA
SAPK - Stress-Activated Protein Kinase
МАРК Mitogen-Activated Protein Kinase
JNK - C-Jun N-terminal Kinase
APNA - Aminohexose Pyrimidine Nucleoside Antibiotic
HMG- High Mobility Group
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Ядрышко эукариотической клетки является динамической структурой, в которой происходят транскрипция рибосомных генов (рДНК), процессинг рРНК и сборка прерибосомных субъединиц. Показано также, что эта органелла принимает участие как в процессах пролиферации, так и в процессах клеточного старения и апоптоза. Известно, что структурное состояние ядрышка зависит от уровня метаболизма и способности клеток к пролиферации. Поэтому морфология ядрышек, а также его отдельных компонентов в митозе (ядрышковых организаторов) часто принимаются во внимание в медицинской практике для уточнения прогноза течения заболевания и выбора адекватного курса лечения. Хорошо известно, что состояние ядрышка изменяется в ответ на стрессовые воздействия или после обработки токсическими веществами, подавляющими, например, синтез рРНК или влияющих на уровень фосфорилирования ключевых ядрышковых белков. Однако в современной литературе содержатся лишь отдельные сведения о реакции ядрышка на действие ингибиторов белкового синтеза, включая те из них, которые вызывают гибель клеток путем апоптоза.
Согласно последним данным масс-спектрометрического анализа ядрышка, в его составе присутствует около 700 белков, которые в зависимости от аминокислотного состава или функциональной значимости могут быть объединены в несколько основных групп. Одна из таких групп включает белки, которые принимают участие в регуляции транскрипции рибосомных генов и входят в состав комплекса транскрипционного аппарата РНК полимеразы I -комплекса, осуществляющего транскрипцию рДНК. Общим свойством белков этой группы является их прочная связь с рибосомными генами, которая сохраняется не только в активных ядрышках в интерфазе, но и во время митоза, когда транскрипция рДНК прекращается. Известно, что некоторые из этих
белков изменяют локализацию в ответ на действие химических агентов или физических факторов. Определение чувствительности белков ядрышка к действию стрессовых агентов, таких как ингибиторы транскрипции рибосомных генов и синтеза белка, лежит в основе изучения механизмов их действия на нормальные и опухолевые клетки человека.
Одним из подходов к изучению ядрышка и его белковых компонентов является иммуноцитохимическое выявление белков ядрышка, в основе которого лежит использование моноклональных антител (МКА). В лабораторных условиях антитела обычно получают путем иммунизации животных антигенами разного происхождения или клеточными структурами с дальнейшим применением методов гибридомной биотехнологии. Этим путем были получены МКА к ядерным белкам В23/нуклеофозмину, Ki-67, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) и др.
Способность антител специфически узнавать антигены применяется при изучении свойств и функций белков. Однако панель антител к ядрышковым белкам, обладающих высокой иммунореактивностью, видовой специфичностью и пригодных для проведения медико-биологических исследований, в настоящее время является достаточно ограниченной. В связи с этим, целенаправленное получение новых МКА к ядерным антигенам человека и их идентификация представляет несомненный как научный, так и практический интерес.
Целью работы явилось изучение иммуноцитохимических особенностей ядрышкового антигена, выявляемого новым моноклональным антителом A3, в клетках человека с различным уровнем пролиферации, а также реакции A3 антигена на обработку клеток ингибиторами белкового синтеза.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1.Отработать оптимальные условия иммуноцитохимического окрашивания ядрышкового антигена новым моноклональным антителом, названным «МКА A3».
/
2.0пределить видовую и тканевую специфичность МКА A3, а также описать локализацию A3 антигена в разных типах клеток человека и на основных стадиях клеточного цикла.
3.Изучить локализацию антигена A3 при активации лимфоцитов периферической крови здоровых доноров к пролиферации с помощью стимуляции фитогемагглютинином (ФГА).
4.Изучить влияние ингибиторов синтеза белка (анизомицина, пуромицина и циклогексимида) на локализацию A3 антигена.
5.Исследовать колокализацию A3 антигена с известными белками ядрышка клеток человека до и после действия на клетки ингибиторов белкового синтеза. б.Определить взаимосвязь между изменениями в локализации A3 антигена и гибелью клеток, вызываемую подавлением синтеза белка.
НОВИЗНА
С помощью нового моноклонального антитела, секретируемого мышиной гибридомой A3, выявлен антиген, располагающийся в ядрышках клеток человека, обладающий четкой видовой специфичностью, названный "A3 антиген", и имеющий основные свойства, характерные для компонентов комплекса РНК полимеразы I.
Дана характеристика и выявлены особенности A3 антигена. Показано, что в пролиферирующих клетках человека в отличие от покоящихся A3 антиген выявляется в виде многочисленных дискретных фокусов, расположенных исключительно в зоне ядрышка. Количество фокусов A3 антигена уменьшается при ингибировании транскрипции рДНК. Отличительной особенностью A3 антигена является его высокая лабильность, которая проявляется в его миграции из ядрышка в нуклеоплазму под действием ингибиторов белкового синтеза. Обнаружено, что изменения в локализации A3 антигена предшествуют массовой гибели клеток путем апоптоза, что позволяет рассматривать этот
феномен-как-маркер-ранних-стадий-апоптотической-гибели-клетокчеловекав
культуре.
Обнаружено, что при длительном культивировании (в течение 4-6 месяцев) человеческих клеток HeLa наблюдается спонтанная «миграция» A3 антигена из ядрышка в нуклеоплазму, что сопровождается повышением чувствительности культуры к внешним воздействиям.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Выявлен ядрышковый антиген белковой природы, названный A3 антиген, обладающий не только видовой специфичностью, но и способностью изменять локализацию под действием ингибиторов белкового синтеза, что дополняет фундаментальные представления о свойствах белков ядрышка.
Разработан метод объективной визуальной оценки общего состояния культур клеток человека, определяемого по локализации A3 антигена. Показано, что появление клеток с атипичной - внеядрышковой - локализацией A3 антигена указывает на "старение" клеток и их повышенную чувствительность к внешним воздействиям.
Видовая специфичность МКА A3 может оказаться полезной для выявления возможной контаминации культур клеток человека клетками другой видовой принадлежности.
Высокая реактивность в иммуноцитохимических реакциях позволяет использовать МКА A3 в качестве положительного контроля в клинико-лабораторных исследованиях при тестировании различных антител.
Изменения в локализации A3 антигена, наблюдаемые при ингибировании синтеза белка, позволяют использовать этот феномен при изучении механизмов действия новых антибиотиков и цитостатических препаратов, а также оценке их способности ингибировать синтез белка в опухолевых клетках человека in vitro.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Антиген, выявляемый МКА A3, является ядрышковым белком, относящимся
к комплексу РНК полимеразы I.
2. Обработка клеток ингибиторами белкового синтеза (анизомицином,
пуромицином или циклогексимидом) приводит к миграции A3 антигена из
ядрышка в нуклеоплазму, где он локализуется в виде дискретных фокусов.
3. Изменения в локализации A3 антигена относятся к ранним маркерам
апоптотической гибели клеток человека в культуре.
4. Длительное культивирование клеток HeLa приводит к спонтанной
релокализации A3 антигена из ядрышка в нуклеоплазму.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные положения диссертации были представлены в виде постерных докладов на конференции Annual BIOCITY Symposium CELL STRESS, (Turcu, Финляндия) в августе 2006 , а также на VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва) в сентябре 2006 г. Диссертационная работа апробирована 24 декабря 2007 на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» ГУ ГНЦ РАМН.
Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии Гематологического научного центра РАМН (зав. лаб. - проф., д.м.н. Т.И. Булычева) и в лаборатории структурной биохимии Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (зав.лаб.-проф., д.б.н. О.В.Зацепина)
