Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
-
Растворимые формы дифференцировочных антигенов 10
-
Характеристика CD38 антигена 12
-
Характеристика CD50 антигена 17
-
CD95 (Fas) антиген, опосредующий апоптоз 21
-
Комплекс HLA I класса-Р2-микроглобулин 28
-
Иммунный ответ при вирусных инфекциях 35
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45
-
Исследуемые образцы и объем наблюдений 45
-
Используемые моноклональные антитела 46
-
Получение козьих поликлональных антител, специфичных к поверхностным антигенам мононуклеарных клеток
крови человека 47
-
Перийодатный метод синтеза конъюгата 47
-
Иммуноферментные методы определения растворимых
форм мембранных антигенов клеток иммунной системы 48
2.6. Реакция непрямой иммунофлуоресценции 50
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 53
-
Разработка и апробация иммуноферментного метода для выявления растворимых форм дифференцировочных антигенов: CD38, CD50 и CD95 53
-
Исследование содержания растворимых форм мембранных антигенов в сыворотке крови больных вирусным гепатитом В 61
3.3. Сывороточное содержание растворимых форм поверхност
ных антигенов клеток иммунной системы при вирусном гепа
тите С 85
3.4. Уровень растворимых форм мембранных антигенов при сме-
шанной гепатитной инфекции 108
3.5. Содержание растворимых форм мембранных антигенов кле
ток иммунной системы в сыворотке крови носителей марке
ров вирусного гепатита G 117
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 134
ВЫВОДЫ 144
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 146
4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АЛТ - аланин-аминотрансфераза
ИФА - иммуноферментный анализ
МКА - моноклональные антитела
ОГВ - острый гепатит В
ОГС - острый гепатит С
ПХ - пероксидаза хрена
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ХГВ - хронический гепатит В
ХГС - хронический гепатит С
HBV - hepatitis В virus (вирус гепатита В)
HCV - hepatitis С virus (вирус гепатита С)
HGV - hepatitis G virus (вирус гепатита G)
OD - optical density (оптическая плотность)
sCD38 - растворимая форма CD38 антигена
sCD50 - растворимая форма CD50 антигена
SCD95 - растворимая форма CD95 антигена
sHLA-l - растворимая форма молекул главного комплекса гистосовместимо-
сти I класса
Введение к работе
Актуальность проблемы
В основе иммунного ответа лежат межклеточные и межмолекулярные взаимодействия, важную роль в реализации которых играют мембранные белки клеток иммунной системы. Известно, что мембранные белки могут иметь растворимые изоформы, образующиеся за счет шеддинга или альтернативного сплайсинга матричной РНК. Растворимые формы поверхностных протеинов клеток иммунной системы обладают иммунорегуляторными свойствами. Получены данные о том, что они могут выполнять функции ограничителей иммунных реакций или же выступать в роли активаторов иммунологических процессов, участвуя в передаче активационных сигналов. Кроме того, при ряде заболеваний сывороточный уровень отдельных мембранных рецепторов является мониторинговым показателем течения патологического процесса [19, 81]. В настоящее время идентифицировано более 240 дифферен-цировочных антигенов, большинство которых является мембранными белками клеток иммунной системы. Информация о наличии и функциональной роли растворимых форм дифференцировочных антигенов получена лишь для немногих из них. Таким образом, исследование количественного содержания растворимых форм (s-форм) мембранных белков клеток иммунной системы имеет как практическое, так и теоретическое значение.
Вирусные гепатиты продолжают оставаться одной из главных проблем здравоохранения как в нашей стране, так и в большинстве стран мира. Ежегодно от патологии, связанной с вирусными гепатитами, включая цирроз печени и первичную клеточную карциному, умирают более 1 млн. человек. В мире насчитывается свыше 150 млн. носителей вирусного гепатита С [26]. Широкая распространенность вирусных гепатитов с парентеральным путем передачи обусловливает актуальность детального исследования молекулярных механизмов иммунного ответа при данных социально-значимых вирусных заболеваниях. Это относится и к изучению роли растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы в патогенезе вирусных гепатитов.
Цель исследования
Определить содержание растворимых форм CD38, CD50, CD95 антигенов и растворимых антигенов HLA I класса в сыворотке крови больных вирусными гепатитами с парентеральным механизмом передачи.
Задачи
Разработать иммуноферментные методы определения растворимых форм антигенов CD38, CD50 и CD95, мембранные изоформы которых принадлежат к различным функциональным группам поверхностных белков клеток иммунной системы.
Определить сывороточный уровень растворимых молекул HLA I класса, растворимых CD38, CD50, CD95 антигенов при остром и хроническом вирусном гепатите В.
Исследовать сывороточное содержание этих протеинов при остром и хроническом гепатите С.
Проанализировать связь между сывороточным уровнем растворимых форм исследуемых белков и особенностями течения вирусных гепатитов В и
5. Оценить характер изменения сывороточного содержания молекул HLA I класса, растворимых форм CD38, CD50 и CD95 антигенов у носителей моле- кулярно-генетических и иммунологических маркеров вирусного гепатита G.
Положения, выносимые на защиту
Разработаны иммуноферментные методы определения относительного содержания растворимых форм мембранных антигенов CD38, CD50, CD95 в сыворотке крови.
При вирусных гепатитах В, С и G выявлен дисбаланс сывороточного уровня растворимых форм CD38, CD50, CD95 антигенов и HLA I класса.
Каждая форма вирусного гепатита (В, С, G и микст-формы) характеризуется своей, индивидуальной картиной изменения сывороточных уровней растворимых форм исследованных антигенов.
7 Научная новизна
Впервые исследован уровень SCD38 и sCD50 антигенов при вирусных гепатитах В и С. Показано, что концентрация sCD38 возрастает как при вирусном гепатите В, так и при вирусом гепатите С, тогда как статистически достоверно повышенный уровень SCD50 ассоциирован только с хроническим течением вирусного гепатита С. Обнаружено достоверное увеличение уровней всех четырех исследованных антигенов при одновременном инфицировании организма вирусами гепатитов В и С. Проведено комплексное изучение сывороточного содержания sCD38, sCD50, sCD95 и sHLA-l антигенов при HGV-инфекции. Установлено, что при инфицировании организма вирусом гепатита G повышается сывороточный уровень растворимых форм CD38, CD50 и CD95 антигенов. Содержание SCD38 и sCD95 антигенов постепенно нормализуется в процессе освобождения организма от вируса.
При вирусных гепатитах В и С осуществлена сравнительная оценка экспрессии мембранных изоформ CD38, CD50 и CD95 антигенов и сывороточного содержания их растворимых аналогов.
Как в сыворотке крови здоровых доноров, так и в сыворотке больных вирусными гепатитами, обнаружено присутствие предположительно олиго-мерной формы sCD95 антигенов. Характер изменения уровня олигомерного sCD95 антигена при вирусных гепатитах В и С отличается от характера изменения сывороточного содержания суммарного SCD95 антигена. Максимально высокие концентрации суммарного sCD95 антигена обнаружены у больных гепатитом С, имеющих сывороточные антитела класса IgM, направленные против core антигена HCV. У больных острым гепатитом В повышенные уровни олигомерного sCD95 антигена связаны с наличием в крови HBeAg.
В отличие от больных хроническим вирусным гепатитом С, не употреблявших наркотики, и имевших высокое содержание олигомерного sCD95 антигена, наркозависимые больные гепатитом С характеризуются нормальным сывороточным уровнем олигомерного SCD95 антигена.
Продемонстрировано, что сывороточная концентрация sCD38 антигена при хроническом гепатите С возрастает у больных, положительных по РНК HCV, и коррелирует с уровнем АЛТ. Больные, отрицательные по РНК HCV, имеют высокие сывороточные концентрации sHLA-l. При вирусном гепатите В наибольший уровень sHLA-l обнаружен в сыворотке крови крови больных, характеризующихся повышенным уровнем активности АЛТ и положительных по HBeAg.
Как у здоровых доноров, так и у больных вирусными гепатитами В и С, обнаружена корреляционная взаимосвязь между сывороточным содержанием олигомерного sCD95 и sCD50 антигенов. Полученные данные расширяют знания о роли растворимых форм мембранных антигенов в реализации иммунного ответа при вирусных инфекциях.
Практическая значимость работы
С использованием моноклональных и поликлональных антител разработаны иммуноферментные методы определения антигенов CD38, CD50 и CD95 (суммарной и олигомерной формы) в биологических жидкостях. Методы применимы для изучения роли этих белков в молекулярных механизмах иммунных реакций, а также для определения прогностической значимости уровня растворимых форм данных антигенов при различных заболеваниях. На основе метода определения растворимой формы CD95 антигена совместно с Нижегородским НИИ травматологии и ортопедии разработан способ определения функционального состояния клеточного звена иммунной системы у пациентов с термической травмой. На данный способ получен патент № 2176795.
Показана принципиальная возможность использования сывороточного уровня растворимых форм CD38, CD95 антигенов и sHLA-l в качестве прогностических показателей течения вирусных гепатитов. Предполагается применение разработанных тестов для контроля эффективности интерферонотера-пии больных вирусным гепатитом С.
Апробация работы
Результаты работы представлены на IV и VI Нижегородской сессии молодых ученых (Н.Новгород, 1999, 2001); III и IV Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С и D -проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 1999, 2001); II Съезде иммунологов России (Сочи, 1999); III Съезде иммунологов и аллерго-
9 логов стран СНГ (Москва, 2000); Научно-практической международной конференции, посвященной памяти академика РАМН и РАМТН И.Н. Блохиной «Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской биотехнологии» (Москва, 2000); Научной конференции «Естественные факторы защиты в профилактике и лечении экологически обусловленных заболеваний» (Н. Новгород, 2000); Научно-практической конференции «Гепатит С (Российский консенсус)» (Москва, 2000); ll(IV) Конгрессе специалистов клинической лабораторной диагностики (Москва, 2000); 8-й Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (С.-Петербург, 2000); VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002).
По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ.
Апробация диссертации состоялась на расширенной межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной 15 октября 2002 года.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа в объеме 164 листов состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 27 рисунками и 22 таблицами. Библиографический указатель включает 191 источник литературы (36 отечественных и 155 иностранных авторов).
![Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]](/i/i/4353/180098.png "Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс] Голубенко Рамиля Ахметовна")
