![Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]](/i/b/3330/180098.png "Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]")
![Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]](/i/d/3890/180098/450/1.png "Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]")
![Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]](/i/d/3890/180098/450/2.png "Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]")
![Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]](/i/d/3890/180098/450/3.png "Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]")
![Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]](/i/d/3890/180098/450/4.png "Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]")
![Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]](/i/d/3890/180098/450/5.png "Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]")
Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Общая характеристика больных и доноров 37
2.2. Методы исследования 44
ГЛАВА 3. Значение плазменнорастворимых hla в диагностике острой и хронической реакции трансплантат против хозяина 52
3.1. Динамика плазменнорастворимых HLA у больных с острой и хронической реакцией трансплантат против хозяина методом ингибиции лимфоцитотоксических анти-HLA антител 52
3.2. Определение плазменнорастворимых HLA методом иммуноферментного анализа 72
3.3. Анализ динамики химеризма у больных с острой и хронической реакцией трансплантат против хозяина 77
ГЛАВА 4. Иммуносерологические показатели у реципиентов костного мозга 82
4.1. Изучение частоты выявления антиэритроцитарных антител, естественных изогемагглютининов и лимфоцитотоксических антител 82
4.2 Изучение специфичности метода ингибиции лимфоцитотоксических анти-HLA антител
Заключение 96
Выводы 107
Список литературы
- Общая характеристика больных и доноров
- Определение плазменнорастворимых HLA методом иммуноферментного анализа
- Анализ динамики химеризма у больных с острой и хронической реакцией трансплантат против хозяина
- Изучение специфичности метода ингибиции лимфоцитотоксических анти-HLA антител
Общая характеристика больных и доноров
Трансплантация костного мозга (ТКМ) - метод, включающий при гемобластозах принципиально новые факторы влияния на опухоль -воздействие сверхвысоких доз цитостатических препаратов и возникающих при этом иммунологических реакций «трансплантат-против-хозяина» (РТГГХ) и «трансплантат-против-лейкоза» [23]. Высокодозная химио - и радиотерапия может полностью уничтожить опухолевые клетки реципиента и, одновременно, в значительной мере подавить способность иммунокомпетентных клеток к отторжению донорского костного мозга. Одновременно освобождается пространство для заселения аллогенными донорскими клетками-предшественницами, которые замещают костный мозг хозяина, обеспечивая нормальный гемопоэз и восстановление иммунной системы.
ТКМ является одним из наиболее эффективных методов терапии больных с гематологическими опухолями. В зависимости от источника получения клеток ТКМ подразделяется на несколько видов. Различают аллогенную трансплантацию костного мозга (аллоТКМ), при которой донором является здоровый человек (родственник или нет), полностью или частично идентичный с реципиентом по антигенам главного локуса гистосовместимости (HLA система). Сингенной называется ТКМ, если донором является идентичный гомозиготный близнец. При аутологичной трансплантации источником гемопоэтической ткани служит собственный костный мозг больного или стволовые клетки периферической крови, полученные в период ремиссии основного заболевания. Аутологичная трансплантация гемопоэтических клеток при острых лейкозах (ОЛ) осуществляется после применения, главным образом, миелоаблативных противоопухолевых режимов подготовки [25]. Однако, при аутотрансплантации высока вероятность реинфузии с трансплантатом опухолевых клеток, что обусловливает отсутствие эффекта «трансплантат против лейкоза» и повышенный риск развития посттрансплантационных рецидивов у больных острым лейкозом, хотя 4-х - 5-ти летняя безрецидивная выживаемость реципиентов может превышать 40% [50, 141, 156, 160]. Очистка костного мозга при аутотрансплантации способствует увеличению безрецидивной выживаемости, по крайней мере, пациентов, которым она проведена в период II или последующих ремиссий. В то же время манипуляции с трансплантатом in vitro могут приводить к увеличению числа случаев его несостоятельности [77, 114, 142, 184]. Трансплантация аллогенного костного мозга впервые была успешно произведена в конце 60-х годов, а в 70-х годах получила всеобщее признание. Интерес к алло-ТКМ был вызван тем, что с помощью миелотрансплантации удавалось полностью излечить больных лейкозами, лимфомами, рядом других гематологических заболеваний. В середине 80-х годов этот метод лечения гемобластозов вошел в широкую практику, число аллогенных ТКМ значительно возросло во всем мире. К 2000 году в мире было выполнено более 80 тыс. трансплантаций аллогенного костного мозга[8].
Если трансплантация аллогенного костного мозга выполняется во время I ремиссии ОЛ, то 5-летняя актуриальная безрецидивная выживаемость пациентов может достигать 46-72%, а частота рецидивов не превышает 15 - 18% [27, 38, 54, 193]. По данным большинства авторов [114, 141, 184], в том числе и работ сотрудников отделения химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН, 5-летняя безрецидивная выживаемость достигается в среднем у 50-60% больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ), которым ТКМ произведена в I хронической фазе [15]. Аллогенная ТКМ остается единственным методом, способным излечить больных ХМЛ. Из пациентов с ОЛ и ХМЛ, которым алло-ТКМ произведена в более продвинутых фазах заболевания, число долгожителей снижается примерно до 10-20% [47, 74].
Важное место в успехе аллоТКМ принадлежит выбору режимов кондиционирования, с помощью которых должна быть получена наиболее полная эрадикация опухолевого кроветворения и иммуносупрессия, необходимая для приживления трансплантата. При ОЛ наиболее часто используются следующие программы предтрансплантационной подготовки: циклофосфан 120 мг/кг + тотальное облучение (ТОТ) в общей дозе 12 Грей, бусульфан 16 мг/кг + циклофосфан 120 мг/кг, бусульфан 16 мг/кг + циклофосфан 120 мг/кг в сочетании с другими химиопрепаратами, чаще с этопозидом ицитарабином [147, 164, 168].
Бусульфан является алкилирующим агентом с выраженными миелоаблативными свойствами и значительной активностью по отношению к покоящимся клеткам костного мозга. Peters W с соавторами показали, что его концентрация в плазме крови имеет достаточно стабильный уровень, что обусловлено линейной зависимостью скорости абсорбции и элиминации от дозы и времени [72, 121]. Максимально переносимая доза бусульфана, включенного в режим кондиционирования перед аллогенной ТКМ составляла в этой работе 20 мг/кг [121]. В другом исследовании (Deeg H.J. с соавторами) при эскалации общей дозы бусульфана с 9 до 20 мг/кг у пациентов с миелодиспластическим синдромом или у больных пожилого возраста не выявлено увеличения летальности, обусловленной токсичностью режима кондиционирования [62].
Определение плазменнорастворимых HLA методом иммуноферментного анализа
1. Выявление плазменнорастворимых HLA в сыворотке реципиентов проводили с помощью метода ингибиции аллоиммунных лимфоцитотоксических анти-HLA антител. Для этого тест-реагент, содержащий анти -HLA антитела в титре не ниже 1:32, разводили исследуемой сывороткой реципиентов и доноров костного мозга в 2, 4, 8 и т. д. раз. В качестве тест-реагента была использована сыворотка больной С. с лимфоцитотоксическими антителами анти-НЬА-А-2, В-7, В-8 специфичности. Специфичность антител была установлена в лаборатории иммуногематологии по панели стандартных HLA типированных доноров.
Для истощения анти-HLA антител тест-реагент титровали с исследуемой сывороткой реципиентов до и в разные сроки после ТКМ и сывороткой доноров костного мозга в круглодонных 96 луночных планшетах и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После инкубации проводили лимфоцитотоксический тест. Для этого 1 мкл содержимого каждой лунки переносили в планшеты Терасаки и добавляли по 1 мкл лимфоцитов доноров, содержащих с больным или донором костного мозга общие антигены системы HLA. После инкубации в течение 1 часа при температуре +37С добавляли 5 мкл кроличьего комплемента, затем 1 час инкубировали при комнатной температуре. По окончании инкубации содержимое планшет стряхивали и добавляли по 1мкл краски «трипановая синь» и проводили учет результатов. Снижение на несколько разведений или до нулевых значений титра тест-реагента указывало на содержание в сыворотке исследуемого больного растворимых HLA, которые ингибировали анти-HLA антитела тест-реагента (положительный результат). Это выражалось в ступенях: 1 ступень- уменьшение титра тест-реагента на 1 разведение (исходный титр 1:64, после истощения 1:32); 2 ступени - уменьшений титра тест-реагента на два разведения от исходного; максимальное- снижение титра тест-реагента в наших опытах достигало 4 ступеней (исходный титр 1:64, а после истощения 1:4). Если титр лимфоцитотоксических антител тест-реагента оставался исходным после истощения исследуемыми сыворотками реципиентов или доноров и не отличался от титра с сывороткой АВ (IV) группы, то это указывало на отсутствие плазменнорастворимых HLA (отрицательный результат).
2.Применение иммуноферментного анализа для определения плазменнорастворимых антигенов. Наряду с использованием описанной выше методики, принятой в лаборатории иммуногематологии ГНЦ РАМН, был модифицирован метод иммуноферментного анализа применительно к определению плазменнорастворимых антигенов совместно с к.б.н. Т.А.Гаранжа.
Указанный метод широко используется в лаборатории клинико-вирусологической диагностики гепатитов и СПИД ГНЦ РАМН для исследования доноров и больных на наличие гепатитов, СПИД, цитомегаловирусных и других вирусных инфекций. Для обнаружения плазменнорастворимых антигенов системы HLA до настоящего времени он не применялся. Для того чтобы метод ИФА можно было использовать в этих целях потребовалась его модификация. Она состояла в том, чтобы на 1 этапе происходило образование комлекса «моноклональное антитело -плазменнорастворимый антиген». Для этого инкубацию исследуемой сыворотки с антителом W6/32 проводили в отдельной планшете. Было необходимо подобрать разведения моноклонального антитела и конъюгата и определить, какие из них являются рабочими. При этом учитывали рекомендации фирмы-производителя используемых тест-реагентов. Ниже представлено подробное описание разработанной методики.
Лимфоциты выделяли из гепаринизированной венозной крови по стандартной методике в градиенте фикола (Ficoll Histopaque, "Sigma") [14]. Исследуемые сыворотки крови были получены от доноров и больных до трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и в различные сроки после трансплантации (до +919 дня). Пробирку с 5 мл венозной крови без стабилизатора ценрифугировали 15 мин при 3 тыс. об/мин, после чего отбирали сыворотку в микропробирки типа «эппендорф» для хранения. Сыворотки хранились в морозильнике при температуре -20С. Коммерческие продукты. Моноклональное антитело W6/32, реагирующее с мономорфным эпитопом а-цепи молекулы HLA человека I класса (HLA-A, В, С) и молекулярной массой 44-45 Ша - коммерческий продукт фирмы «Сорбент», представляет собой мышиное антитело к HLA человека I типа. Были использованы рабочие разведения 1:100, 1:200, 1:400,1:800,1:1000.
Положительный контроль, содержащий антигены HLA I типа, был предоставлен доктором Jankowska- Gan Е (University of Wisconsin Hospital and Clinics). Анти-мышиный коньюгат IgG козы к антителу W6/32, меченный пероксидазой хрена (фирмы «Сорбент»), использовался в рабочих разведениях 1:800, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000,1:6000.
Анализ динамики химеризма у больных с острой и хронической реакцией трансплантат против хозяина
Мы попытались ответить еще на один вопрос - соответствует ли степень истощения тест-реагента тяжести проявлений РТПХ. С этой целью были проанализированы в сравнении результаты исследования пациентов с острой РТПХ І-ІІ и III-IV степени тяжести, больных с локальной и экстенсивной хронической РТПХ и пациентов, у которых была и острая, и хроническая РТПХ. Также представлялось интересным оценить уровень ПРА у больных с поражением печени при острой и хронической РТПХ. Основанием послужили наблюдения некоторых авторов, изучавших уровень ПРА при органной трансплантации. Они нашли, что отторжение трансплантата, в частности печени, сопровождалось увеличением количества ПРА [59, 66, 134]. Этими авторами было высказано предположение, что печень имеет определенное отношение к образованию ПРА. В каждой из исследуемых групп нами было определено число пациентов, у которых степень истощения тест - реагента была максимальной (на 3-4 ступени). Результаты анализа представлены в табл. 11.
Острая РТПХI-II ст. тяжести 14 4 29 Острая РТПХ. III-IVст. тяжести 9 8 89 ХроническаялокальнаяРТПХ 8 6 75 Хроническая экстенсивная РТПХ 22 12 54 Острая+хроническая РТПХ 18 12 67 Вовлечение печени 15 8 - статистически достоверные данные Наши данные показали, что при острой РТПХ III-IV степени больных, у которых степень истощения тест-реагента достигала 3-4 ступеней, было в 3 раза больше (89%), чем при острой РТПХ I-II степени (29%). Данные статистически достоверны (критерий % Пирсона р 0,05). При локальной и экстенсивной формах хронической РТПХ сравнить полученные данные не представлялось возможным из-за большой разницы в численности этих групп, включивших 8 и 22 пациента соответственно. Выяснилось, что при локальной форме таких пациентов было 75%, а при экстенсивной - 54%, данные статистически недостоверны. Однако, у пациентов с острой и в дальнейшем хронической РТПХ истощение тест-реагента на 3-4 ступени отмечено более чем в 60% случаев.
Хотя у пациентов с вовлечением печени при острой и хронической РТПХ лишь в половине случаев степень истощения тест-реагента превышала 3 ступени, у всех 7 больных с наиболее тяжелыми клиническими проявлениями экстенсивной хронической РТПХ, включавшей помимо вовлечения печени, поражения легких, глаз, слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, степень истощения тест-реагента была максимальной.
На основании этих данных можно прийти к выводу о том, что при острой РТПХ истощение тест-реагента сывороткой больного, отражающее количество ПРА, зависит от степени ее тяжести. При хронической РТПХ, а также у больных с острой, а в дальнейшем и хронической РТПХ, степень истощения тест-реагента достигала максимального уровня у большинства пациентов (у 60-67% соответственно). Преобладания больных с максимальным уровнем ПРА при поражении печени не выявлено, однако, у всех пациентов с наиболее тяжелыми органными поражениями истощение тест-реагента достигало 3-4 ступеней.
В качестве примера приводим наблюдение за больным З.М.А. Больной З.М.А., 23 лет, наблюдается ГНЦ РАМН с мая 2004 года. Диагноз хронического миелолейкоза установлен в ноябре 2003 года. В дебюте заболевания выявлен лейкоцитоз до 147 х 10%. При цитогенетическом исследовании костного мозга обнаружено 100% Ph+ клеток. Проводилась терапия гидроксимочевиной. В июне 2004г. после кондиционирования по программе «бусульфан и циклофосфан» выполнена аллогенная трансплантация костного мозга от HLA - идентичного и MLC - ареактивного донора. Количество миелокариоцитов составило 4,54x108/кг веса. До и в 0 день ПРА выявлены не были. После ТКМ уровень лейкоцитов достиг 0,5х109/л к + 14 дню, 1,0x10% к + 17 дню, а уровень тромбоцитов — до 20,0x109/л к + 15 дню, а до 50,0x109/л к + 26 дню. Период миелоксического агранулоцитоза продолжался 16 дней. В период агранулоцитоза отмечалась лихорадка до 38,0 без четких очагов инфекции. Проводилась антибактериальная, противогрибковая терапия, профилактика острой РТПХ метотрексатом, CSA, преднизолоном. На +21 день выявлялись ПРА, истощение тест-реагента на 2,5 ступени. На +35 день диагностирована острая РТПХ с поражением печени, кишечника, кожи. Проводилась терапия преднизолоном, продолжали обнаруживаться ПРА (2 ступени). Однако стабилизации состояния достичь не удалось, в связи с чем на + 42 день был проведен 5 дневный курс АТГ. В результате - высыпания на коже регрессировали и стали пигментироваться, нормализовался стул, но нарастали признаки поражения печени (отмечалось увеличение билирубина до 213 ммоль/л, щелочной фосфатазы до 1400 и/е). К терапии с +57 дня был добавлен селсепт, а с +80 дня азатиоприн. Постепенно состояние улучшилось и ПРА снизились (1 ступень). Признаки РТПХ постепенно регрессировали, однако сохранялась гипербилирубинемия, увеличение щелочной фосфатазы, в связи, с чем к +50 дню диагностирован переход в хроническую РТПХ, возобновлена терапия азатиоприном. Одновременно отмечена реактивация цитомегаловирусной инфекции, проводилась терапия ганцикловиром. Уровень ПРА в этот период достиг 2,5 ступеней. При обследовании кроветворения на +30, +60, +90 дни после ТКМ сохранялась полная цитогенетическая ремиссия. Через 8 месяцев в гемограмме отмечалась лейкоцитопения (лейкоциты 1,0 х 109/л, сегментоядерных нейтрофилов -1%), умеренная тромбоцитопения (117 х 109/л), ПРА выявлялись до 1,5 ступеней. При обследовании на +180, +240 день - 100% донорское кроветворение. ПРА увеличивались до 3 ступеней в периоды ухудшения в клинике хронической РТПХ и уменьшались до 1 ступени после стабилизации состояния (рис.4)
Изучение специфичности метода ингибиции лимфоцитотоксических анти-HLA антител
Трансплантация костного мозга применяется в практике лечения гемобластозов с середины 80-х годов. К 2000 году в мире было выполнено более 80 тыс. трансплантаций аллогенного костного мозга. Несмотря на широкое использование этого метода одной из основных причин смерти больных в раннем посттрансплантационном периоде является острая реакция «трансплантат против хозяина». По имеющимся данным развитие острой РТПХ отмечается у 50-80% реципиентов аллогенного костного мозга и в 15-20% случаев она приобретает крайне тяжелое течение с летальным исходом. Течение позднего посттрансплантационного периода может значительно осложнять хроническая РТПХ, которая примерно в таком же проценте случаев заканчивается фатально. Ранняя диагностика острой РТПХ может оказать значительное влияние на успех терапии. Поэтому настоящая работа была посвящена вопросам разработки новых методов диагностики, которые могут способствовать своевременной постановке диагноза, особенно, в случае отсутствия ярких и очевидных клинических симптомов РТПХ. В связи с этим были предприняты исследования плазменнорастворимых антигенов у реципиентов костного мозга. Основанием для их проведения послужили публикации зарубежных авторов, посвященные изучению плазменнорастворимых антигенов при органных трансплантациях, в которых было показано, что ПРА увеличиваются при острой реакции отторжения трансплантата. Основным методом выявления ПРА явился метод ингибиции лимфоцитотоксических анти-HLA антител, который используется в ГНЦ РАМН в течение многих лет. Одновременно было уделено внимание модификации альтернативного метода выявления плазменнорастворимых антигенов иммуноферментного анализа (ИФА) для случаев, когда применить метод ингибиции анти-HLA антител не представляется возможным (HLA 97 фенотип пациента не содержит антигены, специфичные анти-HLA антителам тест-реагента).
Нам также было интересно оценить значение иммуносерологических показателей (динамики эритроцитарного химеризма, аутолимфоцитотоксических и антиэритроцитарных антител, естественных изогемагглютининов) в диагностике реакции трансплантат против хозяина.
Под наблюдением находилось 49 реципиентов костного мозга -больных с разными вариантами гемобластозов. Согласно поставленным задачам, прежде всего, предстояло определить частоту выявления ПРА у больных с острой РТПХ, установить роль ПРА для ранней диагностики этого осложнения, выявить зависимость между тяжестью острой РТПХ и уровнем ПРА с учетом степени истощения тест-реагента. Эти исследования проведены у 43 реципиентов костного мозга. Острая РТПХ развилась у 23 больных, что составило 53%, плазменнорастворимые антигены были выявлены в 91% случаев. Для подтверждения специфичности появления ПРА при острой РТПХ нами были проанализированы результаты исследования ПРА у больных без острой РТПХ. В результате выяснилось, что из 20 человек, вошедших в исследование, отрицательные результаты выявлены в 80 % случаев. Только у 4 пациентов с + 19, 27, 41 и 84 дней отмечалось появление ПРА и у этих больных в дальнейшем развилась хроническая РТПХ.
Для оценки значения ПРА для ранней диагностики РТПХ нами сопоставлены сроки появления ПРА и диагностики острой РТПХ. Сравнительному анализу было подвергнуто 17 больных. В анализ не вошли 6 человек, которым не проводились исследования в 1 мес. после ТКМ (4 больных) и 2 пациента с острой РТПХ, у которых на протяжении первых 3 мес. исследования ПРА не выявлялись. В среднем каждому пациенту было проведено 16 исследований (от 3 до 33). Максимальные сроки исследования составили 50 мес. Наши данные показали, что у всех 13 пациентов с миелоаблативным кондиционированием сроки развития острой РТПХ и обнаружения ПРА практически полностью совпадали, т.е. появление ПРА не предшествовало диагностике острой РТПХ. В то же время у всех 4 пациентов с немиелоаблативным кондиционированием.ПРА были выявлены раньше, чем появились клинические признаки острой РТПХ (результаты статистически достоверны, критерий Манна-Уитни, р 0,05). Следует заметить, что у 3 из этих пациентов наблюдалась острая РТПХ III-IV степени тяжести, в 1 случае с летальным исходом, и у 3 в дальнейшем развилась экстенсивная хроническая РТПХ. Таким образом, сделан вывод, что наличие ПРА является специфичным для острой РТПХ, а при немиелоаблативном кондиционировании может, видимо, иметь и прогностическое значение, так как у всех таких больных появление ПРА предшествовало развитию острой РТПХ. Обратил на себя внимание тот факт, что после миелоаблативного кондиционирования развитие острой РТПХ при ХМЛ наблюдалось в более ранние сроки (на +15-47 дни), чем у пациентов с ОЛ, которым также применялось миелоаблативное кондиционирование (на +49-60 дни); соответственно и ПРА обнаруживались у пациентов с ХМЛ раньше (на + 21-44 дни), чем у больных с ОЛ (на + 51-60 дни). Хотя средние показатели сроков появления острой РТПХ и ПРА в указанных группах больных отличались почти в 2 раза, различия оказались статистически недостоверными.
