Содержание к диссертации
Список сокращений 5
Введение 7
Глава 1. Обзор литературных данных 12
1.2. Молекулярно-генетические маркеры острого лимфобластного
лейкоза 13
Молекулярно-генетические маркеры острого миелобластного лейкоза 14
Принципы терапии острых лейкозов 17
Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых
клеток 18
Показания к аллоТГСК при острых лейкозах 22
Рецидивы острых лейкозов 23
Факторы, определяющие прогноз при аллоТГСК 25
Полиморфизм иммунорегуляторных цитокинов 26
Полиморфизм гена множественной лекарственной резистентности 28
Методы диагностики минимальной остаточной болезни 28
Гемопоэтический посттрансплантационный
«химеризм» (ПТХ) 33
Дополнительные маркеры «минимальной остаточной болезни» 35
Биологические образцы, используемые для определения «минимальной остаточной болезни» (периферическая кровь
или костный мозг) 36
1.14. Клиническая значимость определения МОБ 37
Глава 2. Материалы и методы 40
Общая характеристика исследуемых групп 40
Получение материала и его характеристика 44
Выделение лейкоцитов 44
Выделение геномной ДНК 44
Выделение тотальной РНК 45
Приготовление кДНК 46
2.3. Изучение аллельного полиморфизма генов Ил-6, Ил-10,
МЛР-1 47
2.3.1. Проведение полимеразной цепной реакции 48
Метод исследования ПТХ на основе панели полиаллельных генетических систем 50
Диагностика хромосомных аберраций 52
Количественная ПЦР в режиме реального времени 52
Получение разведений клеточных линий 55
Протокол выделения лимфоцитов на градиенте плотности фикола 55
Количественная интерпретация результатов амплификации 56
2.6. Статистическая обработка результатов исследования 57
Глава 3. Анализ прогностического значения аллельного
полиморфизма генов Ил-6, Ил-10, МЛР-1 .- 58
3.1. Распределение аллельного полиморфизма генов Ил-6,
Ил-10, МЛР-1 в объединенной группе доноров ГСК и реципиентов 59
3.2. Прогностическое значение аллельного полиморфизма
гена Ил-6 60
Прогностическое значение полиморфизма гена Ил-10 66
Прогностическое значение полиморфизма гена МЛР-1 68
Анализ общей выживаемости пациентов после аллоТГСК в зависимости от совпадения полиморфизмов генов Ил-6, Ил-10, МЛР-1 у
доноров ГСК и реципинтов 71
Глава 4. Динамика ПТХ после аллоТГСК. Прогностическое значение
оценки ПТХ 73
4.1. Днамика ПТХ в зависимости от интенсивности
режима кондиционирования 74
4.2. Анализ общей выживаемости пациентов после
аллоТГСК в зависимости от показателей ПТХ на различных сроках 75
Прогностическое значение ПТХ в зависимости от интенсивности режима кондиционирования 79
Анализ частоты рецидивов у пациентов после аллоТГСК
в зависимости от ПТХ 82
ПТХ в зависимости от стадии заболевания на момент аллоТГСК 86
Анализ количественных значений ПТХ 89
Глава 5. Детекция генетических аберраций. Количественная ПЦР в режиме реального времени для диагностики "минимальной остаточной
болезни" у пациентов после аллогенной ТГСК 94
Глава 6. Многофакторное моделирование для оценки степени влияния
изучаемых предикторов на вероятность рецидива после аллоТГСК 98
Глава 7. Обсуждение результатов 113
Выводы 122
Практические рекомендации 123
Список литературы 124
5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ОЛ - острый лейкоз ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз ОМЛ - острый миелобластный лейкоз ХМЛ - хронический миелоидный лейкоз МДС — миелодиспластический синдром НХЛ - неходжкинская лимфома ЛХ - лимфома Ходжкина
АллоТГСК - аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток РТПХ - реакция «трансплантат против хозяина» ПТХ - посттрансплантационный «химеризм» МРК - миелоаблативный режим кондиционирования РКСИД - режим кондиционирования со сниженной интенсивностью доз ОВ - общая выживаемость Ил-6 - интерлейкин 6 Ил-10 - интерлейкин 10
Ген МЛР-1 - ген множественной лекарственной резистентности 1 МОБ - минимальная остаточная болезнь ГСК - гемопоэтические стволовые клетки КМ - костный мозг ПК - периферическая кровь CSA - циклоспорин А МТХ - метотрексат MMF — мофетил-микофенолат Ig - иммуноглобулин TCR- Т-клеточный рецептор Pred - преднизолон Ви - бусульфан Су - циклофосфан ATG — антитимоцитарный глобулин
Ур16-этопозит
Treo - треосульфан
Flu - Флюдарабин
Mel - Мелфалан
AraC - цитозин арабинозид
Ida - идарубицин
Введение к работе
Применение аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК) позволяет достичь излечения у больных с острыми лейкозами, хроническим миелолейкозом, злокачественными лимфомами, при этом общая выживаемость пациентов составляет 50-60% (2, 14, 22, 27, 28, 29, 70, 87, 230, 239).
Широкому распространению аллоТГСК препятствует высокая вероятность развития осложнений раннего (до 100 дней) и позднего периодов (после 100 дней), что существенно снижает не только эффективность лечения, но и качество жизни пациентов. Приживление трансплантата, реакция «трансплантат против хозяина», инфекционные и токсические осложнения определяют течение раннего периода и связаны с особенностями пациентов (возраст, диагноз, стадия заболевания, цитомегаловирусная инфекция) и доноров (пол, совместимость по HLA-системе и группе крови), а также с интенсивностью режимов кондиционирования, профилактикой острой «реакции трансплантат против хозяина», источником гемопоэтических стволовых клеток (3, 43, 81). Рецидивы лейкозов являются основными факторами, снижающими показатели долгосрочной выживаемости пациентов после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (179, 229, 240).
В настоящее время установлена роль различий генома, встречающихся у пациентов и доноров гемопоэтических стволовых клеток, на эффективность, степень выраженности связанных с ней осложнений и отдаленные результаты аллоТГСК (181, 182, 184). Одним из основных осложнений является острая реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ), многие механизмы патогенеза которой в настоящее время не известны. При этом анализируется влияние I и II классов HLA-системы человека, роль минорных антигенов, цитокинов и возможные молекулярно-биологические особенности реципиента и донора (221). Показано, что полиморфизм генов,
8 кодирующих иммунорегуляторные цитокины (интерлейкин-6 (Ил-6), интерлейкин-10 (Ил-10) и др.), гена множественной лекарственной резистентности (МЛР-1), выражается в различной интенсивности иммунного ответа, чувствительности к химиотерапевтическим препаратам, детоксикационной функции (35, 78, 102, ПО). Изучение этих факторов позволит контролировать развитие острой реакции «трансплантат против хозяина» при сохранении эффекта «трансплантат против лейкоза» (133, 150).
Анализ «химеризма» отражает степень приживления гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) донора в организме реципиента (174). Этот метод позволяет косвенно судить о вероятности развития рецидива после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (7, 26, 50, 198). Не менее значимым в оценке прогноза, а, следовательно, и эффективности аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток является мониторирование «минимальной остаточной болезни». Современные методы молекулярно-биологической диагностики обладают высокой разрешающей способностью, чувствительностью и специфичностью, позволяющей определять у пациентов минимальные количества опухолевых клеток, которые могут быть причиной развития рецидива. Химерные гены, образующиеся в результате хромосомных аберраций, являются оптимальной мишенью для исследования «минимальной остаточной болезни» и встречаются в 30-40% случаев острых лейкозов (114).
Таким образом, особенности становления донорского «химеризма» и диагностика «минимальной остаточной болезни» определяют вероятность развития рецидивов после трансплантации. Молекулярно-генетический подход занимает ведущее место среди методов ранней диагностики этих состояний и осложнений, связанных с аллоТГСК, что определяет актуальность исследования связанных с ними факторов.
9 Цель работы.
Определить прогностическое значение различных молекулярно-биологических факторов у пациентов с острыми лейкозами после аллогеннои трансплантации стволовых гемопоэтических клеток.
Задачи исследования:
Установить влияние полиморфизма генов, кодирующих иммунорегуляторные цитокины Ил-6, Ил-10, а так же гена МЛР-1 на общую выживаемость пациентов с острыми лейкозами после аллогеннои трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Оценить риск развития острой реакции «трансплантат против хозяина» в зависимости от полиморфизма генов, кодирующих иммунорегуляторные цитокины Ил-6, Ил-10, а так же гена МЛР-1.
Определить прогностическую значимость становления химеризма после аллогеннои трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в зависимости от режимов кондиционирования.
Разработать протокол диагностики минимальной остаточной болезни на основе количественного определения хромосомных повреждений [t(9;22), t(12;21), t(8;21)] методом обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции у пациентов с острыми лейкозами.
Оценить прогностическую значимость выявления хромосомных повреждений [t(9;22), t(12;21), t(8;21)] на разных сроках после аллогеннои трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Основные положения, выносимые на защиту.
Определение полиморфизма промоторной области гена Ил-6 имеет прогностическое значение в отношении частоты ремиссий острого лейкоза, острой реакции «трансплантат против хозяина» и выживаемости пациентов после аллогеннои трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Полиморфизм гена МЛР-1 у доноров ГСК имеет значение в оценке риска развития тяжелой острой реакции «трансплантат против хозяина».
10 Интенсивность режима кондиционирования, стадия заболевания в момент трансплантации влияют на сроки становления донорского химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Длительность ремиссии острых лейкозов и общая выживаемость пациентов после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток имеют отличия в зависимости от показателей химеризма на различных этапах после трансплантации.
Научная новизна.
Установлено наличие достоверных различий в частоте различных аллельных вариантов гена Ил-6 среди лиц со злокачественными заболеваниями системы крови и здоровых доноров.
Обнаружены различия в частоте рецидивов острых лейкозов, степени тяжести острой РТПХ, общей выживаемости пациентов после родственных и неродственных аллогенных трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток в зависимости от полиморфизма промотерных областей генов иммунорегуляторных цитокинов Ил-6 и Ия-10, а так же полиморфизма гена МЛР-1.
Установлена прогностическая значимость показателей химеризма на различных сроках в отношении вероятности рецидива острого лейкоза и общей выживаемости пациентов после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
Практическая ценность работы.
Молеклярно-биологические факторы прогноза рецидива являются основанием для корректировки терапии у пациентов с острыми лейкозами после аллоТГСК, в том числе, своевременном назначении противорецидивной и иммуноадоптивной терапии.
Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени является высоко чувствительным методом
выявления хромосомных аберраций для определения минимальных количеств опухолевых клеток у пациентов в состоянии ремиссии. Наличие генетических поломок является основанием для ранней диагностики рецидива острого лейкоза и своевременного начала противорецидивнои терапии.
Различия в аллельном генотипе доноров гемопоэтических стволовых клеток и реципиентов по Ил-6, Ил-10, МЛР-1 могут быть дополнительным критерием при подборе доноров ГСК.
Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы были представлены на IV и V симпозиумах «Биологические основы терапии онкологических заболеваний» (Москва, 2005 и 2007), 31-ми 32-м симпозиумах Европейской группы по трансплантации костного мозга (ЕВМТ) (Прага, 2005, Гамбург, 2006), симпозиуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2005), 1-ой Российско-Американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005), 16-ом международном симпозиуме «Современные направления в изучении лейкозов» (Гамбург, 2005),
По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
![Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]](/i/i/4353/180098.png "Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс] Голубенко Рамиля Ахметовна")