Введение к работе
Актуальность проблемы. Иммуноглобулин Е ( IgE ) является ключевым компонентом реакций гиперчувствительности немедленного типа,-Приводящих к патологическим сдвигам в организме и развитию аллергических заболеваний. Широкая распространенность и возрастающее количество аллергических заболеваниий делает все более актуальным изучение этого вида патологии и разработку методов диагностики и лечения. Изучение молекулы IgE имеет большое теоретическое значение, так как связано с выяснением механизма возникновения и развития данного явления. Работа с IgE до недавнего времени была затруднена в связи с чрезвычайно мальм его содержанием в организме человека и слабым накоплением в организме лабораторных животных. Получение и использование моноклонаяьных антител (мкАт) класса IgE, а,также анти-1еЕ-анги-тел, как к целой молекуле, так и к отдельным фрагментам и синтетическим пептидам, отражающим строение отдельных участков молекулы IgE, успехи в генной инженерии позволили начать глубокий анализ структурно-функциональных отношений в молекуле IgE и механизма развития гиперзргических реакций.
В лаборатории гибридом ВНИИ биотехнологии (впервые в стране ) были получены мкАт к IgE человека, и на их основе разработаны тест-системы для определения уровня общего IgE.
Для более углубленного изучения системы IgE представлялось актуальным провести исследование тонкой антигенной специфичности полученных мкАт, а также исследование антигенной структуры молекулы IgE. Важной задачей представлялось также выяснение возможности применения полученных мкАт для препаративного выделения IgE и разработки новых тест-систем для определения уровней общего и аллергенспецифического IgE.
Дели данной работы.
1. Отработка условий получения IgE в препаративных количествах на аффинных иммуносорбентах из различных источников и характеристика полученных препаратов. 2. Характеристика тонкой антигенной специфичности мкАт серии IgE/11 и изучение антигенной структуры молекулы IgE с использованием антител, протеолитических фрагментов и синтетических пептидов. 3. Изучение процесса биосинтеза IgE и роли гликоэили-рования в процессе синтеза и секреции. 4. Разработка ка основе мкАт серии IgE/11 полуколичественного варианта тест-системы для визуального определения уровня общего IgE в сыворотке крови человека б. Разработка на основе мкАт серии IgE/11 тест-системы для определения уровня аллергенспецифического IgE.
Научная новизна и практическая значимость Данная работа проводилась в рамках исследований, предусмотренных отраслевым планом Минмедпрома СССР ( номер государственной регистрации 01.86.0043366 )
В дачной работе впервые проведено изучение антигенной структуры молекулы IgE человека с помощью мкАГ, протеолитических фрагментов и синтетических пептидов и установлена локализация антигенных детерминант, распознаваемых мкАт серии IgE/11. Разработан метод сравнительного изучения тонкой антигенной специфичности мкАт, основанный на использовании ограниченного гротеолиза и иммуноблоттинга; ме'тод может быть использован для паспортизации мкАТ/
Впервые с использованием[ трансфектомы исследован биосинтез молекулы IgE человека и роль гликозилирования в процессе синтеза и секреции. Установлено, чтв гетерогенность 6-цепи молекулы IgE человека обусловлена N-гликозилированием, а полное ингибирование N-гликозили-рования с помошью туникамицина ( Ш ) не блокирует секреции IgE.
Впервые в отечественной практике разработан полуколичественный вариант тест-системы, позволяющий визуально оценивать концентрацию IgE в сыворотке крови человека. Разработанная тест-система не требует дорогостоящего оборудования и предельно проста в использовании. По своим характеристикам тест-система не уступает аналогичным наборам зарубежных фирм. Предложенная тест-система прошла испытания в лаборатории клинической иммунологии Института Иммунологии МЗ СССР, лаборатории клинической аллергологии 2 ЮЛГШ им.ЕЙ.Пирогова и в центре ''Иммунопрофилактики'' АШ СССР.
Исследована возможность использования мкАт серии IgE/11 в тест-системах для измерения уровня аллергенспецифичееких IgE антител. Проведен сравнительный анализ мкАт с антителами, применяемыми в коммерческих тест-системах.
Разработан метод препаративного выделения IgE на аффинных сорбентах с поли- и мкАт серии IgE/11 из IgE содерзкэлдах жидкостей,
Положения выносимые на ващиту: 1. Использование мкАТ серии IgE/11 для выделения IgE в препаративных количествах на аффинных сорбентах. 2. Использование мкАт серии IgE/11 для изучения антигенной структуры молекулы IgE. 3. Изучение процесса биосинтеза IgE и роли гликозилировшгая в процессе синтеза и секреции с помощью трансфектомы. 4. Мэтод полуколичественного определения уровня общего IgE в сыворотке крови человека с визуальной оценкой результатов анализа 5. Использование мкАт серии IgE/11 для определения уровня аллергенспецифичееких IgE антител.
Апробация работы. Диссертация апробирована 12 сентября 1S90 г. на коллоквиуме отдела медицинских диагностикумов НПО "Биотехнологии" Минмедпрома СССР
Материалы диссертации представлялись на;1 съезде иммунологов в г. Сочи 1989г. , республиканской конференции "Иммуноферментный анализ в медицине "г. Харьков 1989 г., школе по молекулярной биологии г. Тарту 1988 г. , 6-ом международном конгрессе по быстрым методам иммуноанализа - "RAMI-90" г. Хельсинки 1990 г.. международном симпозиуме "IgE: регуляция синтеза и клиническая значимость" г. Москва 1990 г.
Публикация результатов исследования. Но материалам диссертации опубликовано 10 работ .
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводоз и списка цитируемой литературы. Диссертационная работа изложена на 155 страницах машинописного текста , включает 11 таблиц и 30 рисунков. Список литературы содержит 189 источников.
