Введение к работе
Актуальность тєліьі. Эпидемиологические исследования свидетельствуют о том, что распространенность бронхиальной астмы в разных странах составляет около 10-15%, а аллергического ринита - более 20%. Каждое десятилетие происходит почти двукратное увеличение количества людей, страдающих аллергическими заболеваниями, причем детальные причины этого феномена еще неясны. Поэтому от состояния научных, разработок в области фундаментальных исследований зависит как эффективность, так и появление новых направлений в диагностике, профилактике и лечении аллергии [DuBuske L.M., 2001; Kowal К, 2006].
Способность Т-клеток (CD4+) распознавать аллергены и отвечать выбросом определенных цитокинов является ключевым фактором в регуляции синтеза IgE, активации тучных клеток, базофилов и эозинофилов, генерации воспаления. На ряде моделей показано, что цитокины обычно продуцируются двумя различными субпопуляциями Т-хелперов - ТЫ и Th2, предшественниками которых являются клетки ThO. Эти клетки, в свою очередь, активируются Т-эпитопами аллергенных белков, которые нарезаются в антиген-презентирующих клетках и экспрессируются в виде комплексов с молекулами главного комплекса гистосовместимости второго класса (МНС-П). У ато-пических больных Т-клеточный репертуар, как в периферической крови, так и в местах контакта аллергена представлен субпопуляцией с Тп2-фенотипом, который генерирует цитокины Тп2-типа: IL-4, IL-5, IL-10 и IL-I3. Эти цитокины модулируют функцию В-лимфоцитов, моноцитов, дендритных клеток и фибробластов, стимулируют переключение продукции антител В-клетками с IgG-изотипа на IgE-изотип. С другой стороны, клетки ТЫ-типа, задействованные в иммунной защите от чужеродных антигенов, секретируют цитокины с «антиаллергенными» свойствами: IL-2, IL-12, IFN-y. У лиц с аллергией число этих.клеток и их активность значительно снижается [Gushchin I.S, 1998; Kowalski M.L., 1998]. Таким образом, продукция IgE-антител, в основ-
ном, зависит от соотношения цитокинов IL-4 и IFN-y, а угнетение секреции IL-4 является, по-видимому, эффективным подходом к аллерготерапии.
IL-4 представляет собой белок с молекулярной массой 15 кДа, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами, тучными клетками и базофи-лами. Он обладает широким функциональным спектром, поэтому не удивительно, что изменение его активности во многом определяет исход ряда патологических состояний, например, при лейшманиозе, проказе, шистосомозе, аллергических заболеваниях и астме. В работах 1993-1996 гг. был описан механизм регуляции активности IL-4 с участием альтернативной формы этого белка — IL-482. Такой укороченный на 16 аминокислот IL-4 образуется в результате естественного альтернативного сплайсинга гена IL-4, как результат элиминация второго экзона, кодирующего аминокислотные остатки 22-37. В тимоцитах и клетках бронхиального экссудата уровень экспрессии мРНК IL-482 выше по сравнению с уровнем мРНК IL-4, что свидетельствует о тканевой специфичности IL-452. Установлено, что IL-452 (рекомбинант-ный) подавляет пролиферацию Т- лимфоцитов, а также конкурирует с полноразмерной формой белка за общие рецепторы на иммунокомпетентных клетках. Из имеющихся в литературе данных следует, что IL-482 зкспресси-руется в основном в тимусе и дыхательных путях, ингибируя функции полноразмерной формы IL-4 [Alms W.J. , 1996; Sorg, R.V. , 1993; Sakkas L.I., 1999]. Предполагают, что IL-452 является регулятором синтеза IgE, приводящим к снижению его уровня в плазме/сыворотке и на поверхности клеток-мишеней - тучных клеток и базофилов. Таким образом, дельта-форма IL-4 может влиять на соотношение Th2/Thl в пользу ТЫ клеток, снижать чувствительность клеток-мишеней к специфическому аллергену и угнетать реакции ранней и поздней фазы аллергического ответа.
В связи с этими воззрениями, мониторинг IL-452 представляет большое теоретическое и практическое значение. Не исключено, что анализ динамики его концентрации в крови позволит прослеживать процессы реконва-
лєсценции при атопической бронхиальной астме и аллергических ринитах, наиболее распространенных сезонных заболеваниях. Количественное определение обеих форм цитокина в клинических образцах может обеспечить новый подход в прогнозировании результатов в процессе терапии больных атопической астмой и поллинозами. Таким образом, работа по созданию тест-системы для количественного определения IL-462 в форме белка является актуальной и перспективной.
Цель работы: анализ пространственной и антигенной структур цито-кинов IL-4 и IL-452 человека, поиск дискриминирущих моноклональных антител для обоих цитокинов, разработка системы для количественного определения IL-452 в биологических образцах. Задачи исследования.
Моделирование трехмерных структур цитокинов IL-4 и IL-482.
Провести структурный анализ и предсказание вероятных В-клеточных эпитопов IL-4 и IL-452.
Синтезировать набор пептидов, имитирующих В-эпитопы обеих форм цитокина.
Получить моноклональные и поликлональные антитела, специфичные к IL-4HIL-4S2.
5. Разработать оптимальный вариант количественного определения IL-452.
Научная новизна.
Построена трехмерная модель IL-452 и проведен анализ структурных отличий обоих цитокинов.
С целью антигенного картирования синтезирован набор пептидов, имитирующих В-эпитопы изучаемых белков и наработаны соответствующие антипептидные антитела.
Получены поликлональные и моноклональные антитела (МКА), специфичные для каждой формы цитокина.
Установлено, что большая часть В-эпитопов IL-4 и IL-452 являются конформационно-зависимыми.
Показано, что район сплайсинга IL-4 обладает повышенной иммуно-генностью.
Создан метод количественного определения IL-452 в биологической среде.
Зарегистрирована кинетика накопления IL-482 в супернатантах от стимулированных тимоцитов человека.
Практическая значимость. Ввиду того, что IL-462, является антагонистом полноразмерного IL-4, анализ динамики концентрации обоих цито-кинов в крови позволит прослеживать процессы реконвалесценции при аллергических заболеваниях, атопической бронхиальной астме и ринитах, в мониторинге других заболеваний, связанных с повышенной секрецией IL-4.
Количественное определение обеих форм цитокина в клинических образцах может обеспечить новый подход в прогнозировании результатов при терапии аллергических' заболеваний. Доступность количественного анализа открывает возможность изучения механизмов регуляции экспрессии и активности цитокинов группы IL-4, взаимосвязи между экспрессией мРНК и соответствующей белковой формой.
Разработанные в настоящей работе методы и подходы могут быть применены для разработки методических рекомендаций для врачей-клиницистов, занимающихся лечением аллергических больных с целью оценки качества проводимого лечения и контроля процессов реконвалесценции.
Апробация работы. Результаты исследования докладывались на II, III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (6-8 июня 2005 г, Санкт-
Петербург; 16-21 сентября 2007 г, Пушино, Россия); IV Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (11-14 сентября 2006 г, Москва, Россия); VIII Российском конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (27-29 июня 2007 г, Москва, Россия); II Международном конгрессе «Иммунитет и болезни» (10-14 сентября 2007 г, Москва, Россия); Объединенном иммунологическом форуме (30 июня-5 июля 2008 г, Санкт-Петербург, Россия); X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (20-23 мая 2009 г, Казань, Россия); XXVIII конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии (6-Ю июня 2009 г, Варшава, Польша). Основные результаты диссертационной работы отражены в 7 публикациях.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа построена по традиционному плану, изложена на 120 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, разделов, описывающих материалы и методы исследований, результаты, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 17 рисунками, включая фотографии. Список использованной литературы включает 144 источника, из них 13 отечественных и 131 зарубежных.
![Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) [Электронный ресурс]](/i/i/4438/210884.png "Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) [Электронный ресурс] Вязникова Татьяна Владимировна")
![Особенности субпопуляции цитокинопродуцирующих клеток (INF\Nc#2+#1 и IL-4#2+#1) при атопической и смешанной формах бронхиальной астмы [Электронный ресурс]](/i/i/4272/204990.png "Особенности субпопуляции цитокинопродуцирующих клеток (INF\Nc#2+#1 и IL-4#2+#1) при атопической и смешанной формах бронхиальной астмы [Электронный ресурс] Удалова Валентина Александровна")