Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Комбинированные вакцины: история, принципы конструирова ния и проблемы оценки эффективности их применения (обзор данных литературы) 12
Глава 2. Материалы и методы 51
Глава 3. Конструирование комбинированных вакцин 66
3.1. Экспериментальное обоснование включения вакцины гепатита В в состав комбинированных вакцин 67
3.2. Изучение влияния комбинированных вакцин на клеточный и гуморальный ответ у животных .74
3.3. Разработка технологии получения комбинированных вак
цин... - ..104
Глава 4. Конструирование иммуноферментных тест-систем для диагностики управляемых инфекций (дифтерия, столбняк, гепатит В) 117
4.1. Разработка технологии получения антивидового конъюгата F(ab')2-фрагментов антител сыворотки лошади против IgG человека аффинноочищен-ных, меченых пероксидазой хрена —. 118
4.2. Конструирование ИФТС для определения специфических антител с использованием антивидового конъюгата 131
4.3. Конструирование ИФТС для определения специфических антител на основе авидин-биотинового взаимодействия 141
4.4. Разработка методики количественного иммуноферментного определения специфических антител (на модели тест-системы для определения дифтерийных антител) 146
4.5. Оценка валидности рабочих характеристик разработанных тест-
систем с точки зрения количественного анализа 155
Глава 5. Применение разработанных тест-систем для контроля эффективности вакцинации против дифтерии, столбняка и гепатита В, а также отбора плазмы доноров для производства специфических иммуноглобулинов 172
5.1. Использование ИФТС (непрямой вариант) для определения уровня дифтерийного и столбнячного антитоксинов в человеческих сыворотках .... 172
5.2. Использование ИФТС (авидин-биотиновый вариант) для определения анти-HBs 177
5.3. Использование ИФТС (авидин-биотиновый вариант) для опреде
ления антитоксинов в сыворотках крови людей и животных 180
5.4. Изучение иммуногенности вакцин «Бубо-М» и «Бубо-Кок» в на
блюдениях на взрослых и детях 185
Заключение 196
Выводы ....213
Список литературы 216
Приложение 254
- Комбинированные вакцины: история, принципы конструирова ния и проблемы оценки эффективности их применения (обзор данных литературы)
- Экспериментальное обоснование включения вакцины гепатита В в состав комбинированных вакцин
- Изучение влияния комбинированных вакцин на клеточный и гуморальный ответ у животных
- Разработка технологии получения антивидового конъюгата F(ab')2-фрагментов антител сыворотки лошади против IgG человека аффинноочищен-ных, меченых пероксидазой хрена
- Использование ИФТС (непрямой вариант) для определения уровня дифтерийного и столбнячного антитоксинов в человеческих сыворотках
Введение к работе
Вакцинопрофилактика является высокоэффективной мерой борьбы с инфекционными болезнями, воздействующей на важнейший регулятор эпидемического процесса - иммунитет населения. Успешная реализация программы ВОЗ по ликвидации оспы в мире резко повысила престиж вакцинации. В 1974 году была принята «Расширенная программа иммунизации» (РПИ), выполняя которую все страны добились впечатляющих успехов в предупреждении основных инфекционных заболеваний [66, 67, 94].
Вместе с тем возможности вакцинопрофилактики далеко не исчерпаны не только в отношении заболеваний, пока еще не входящих в круг управляемых, но и в отношении таких «добрых старых» инфекций, как коклюш, корь, дифтерия, краснуха, паротит. Во всем мире от инфекций, потенциально управляемых методами иммунопрофилактики, ежегодно погибает 12 миллионов детей, число детей, ставших инвалидами, а также расходы на лечение вообще подсчитать невозможно [87,89,90].
Таким образом, в ближайшей перспективе мы не в праве ожидать снижение числа инфекций, подлежащих активной иммунопрофилактике. Более того, предполагается, что календарь прививок 2025 года будет включать вакцинацию против 35-40 заболеваний. Так, уже сейчас в первые 2 года жизни ребенок получает более 15 инъекций [95, 268].
Для решения этой проблемы приказом Минздрава России от 18 декабря 1997 года № 375 «О календаре профилактических прививок» предусмотрено одновременное (в один день) проведение вакцинации препаратами, указанными в календаре профилактических прививок. Данное положение приказа привело отечественные правила проведения прививок в соответствие с международными, существующими последние 10 лет. Одномоментная вакцинация, не сопровождающаяся угнетением иммунного ответа к какому-либо из антигенов и потенцированием реактогенности, позволяет не только более успешно реализовать проведение прививок в декретированные сроки, но и снизить загруженность медицинских работников.
Вместе с тем при одномоментной вакцинации остается нерешенным ряд вопросов, таких как нереальность парентеральной иммунизации более чем двумя препаратами, избыточная инокуляция сорбента и консерванта в случае их содержания в обоих вакцинных препаратах и, наконец, проблема транспортирования и хранения большого количества термолабильных препаратов, а также наличия всех показанных для единовременного применения вакцин.
Поэтому приоритетным направлением современной вакцинологии является программа разработки поливалентных комбинированных препаратов.
Особенно актуальными являются исследования по созданию комбинированных вакцин с включением в них компонента со специфической направленностью против гепатита В. HBV-инфекция, характеризующаяся тяжелыми, потенциально летальными осложнениями, такими как цирроз и первичный рак печени, продолжает оставаться серьезной проблемой современного здравоохранения. У новорожденных гепатит В в 90 % случаев принимает хроническое течение, при заражении на первом году жизни - в 50 %, у взрослых - в 5-10 % [109, 110, 111, 131, 193]. Это указывает на первостепенную важность защиты детей самого раннего возраста [90, 149,150].
В связи с этим, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, отечественным календарем прививок предусмотрена вакцинация против ГВ всех новорожденных и детей первого года жизни.
Выполнение этой программы может быть в значительной мере упрощено при объединении НВ-вакцины с другими вакцинами (АКДС, АДС), включенными в РПИ, в комбинированных препаратах. Положительный опыт по применению вакцин такого класса получен за рубежом [268, 269, 192, 225, 226, 271].
Успех программы вакцинопрофилактики во многом определяется эффективностью эпидемиологического надзора за управляемыми инфекциями, в котором важная роль принадлежит серологическому мониторингу специфического антиинфекционного иммунитета [48, 49, 59]. В практическом здравоохранении России для этой цели широко используется реакция пассивной гемагглютинации [6, 44], которая при простоте выполнения, достаточной экспрессности и чувствительности, обладает рядом существенных недостатков, из которых основной - невозможность получения точного количественного результата, т.к. учет проводится визуально и поэтому достаточно субъективен [36].
Необходимость определения иммунного статуса населения для систематической оценки прививочной работы и осуществления постоянного контроля за эпидобстановкой требуют разработки новых диагностических препаратов со стандартизованными свойствами, пригодных как для проведения массовых обследований в очагах и определения напряженности иммунитета в процессе вакцинации, так и оценки качества новых профилактических препаратов.
Современным требованиям эпидемиологической практики в значительной степени отвечает иммуноферментный анализ (ИФА), который стал одним из ведущих в области качественных и, что особенно важно, количественных определений в биологических пробах. В настоящее время ИФА включен в число обязательных методов экспресс-диагностики, рекомендованных ВОЗ [343]. Именно ИФА является одним из таких серологических методов, которые могут способствовать организации более совершенной системы диагностики иммунитета, сделать её более эффективной на основе точной инструментальной оценки уровня специфических антител [29].
Таким образом, анализ опубликованных за последние годы в отечественной и иностранной литературе исследований позволяет сделать заключение, что наиболее актуальными вопросами проблемы специфической профилактики и диагностики управляемых инфекций являются: создание базовых комбинированных вакцин, направленных на профилактику нескольких инфекций одновременно; совершенствование лабораторных методов диагностики контролируемых инфекций.
Цель исследования - экспериментально обосновать и разработать конструкции комбинированных вакцин и иммуноферментных тест-систем для профилактики и диагностики управляемых инфекций (дифтерия, столбняк, коклюш и гепатит В).
Задачи исследования
Экспериментально обосновать конструкции комбинированных вакцин, предназначенных для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В.
Разработать технологию изготовления комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В с оформлением нормативно-технической документации для их производства.
Разработать иммуноферментные тест-системы для количественного определения специфических антител (дифтерийных, столбнячных, анти-HBs) с оформлением нормативно-технической документации для их производства.
Продемонстрировать эффективность применения разработанных тест-систем для оценки поствакцинального иммунитета у людей, оценки иммуногенности вакцин на животных, отбора плазмы доноров с высоким содержанием специфических антител для производства направленных иммуноглобулинов.
Научная новизна
Впервые в эксперименте оценен эффект объединения вакцины гепатита В с вакцинами АДС-М и АКДС. Установлен выраженный потенцирующий эффект как анатоксинов (дифтерийного, столбнячного), так и коклюшного компонента на формирование клеточного и гуморального иммунного ответа против гепатитного компонента комбинированных вакцин. Обнаруженный эффект позволил уменьшить дозу гепатитного компонента в составе разработанных комбинированных вакцин без изменения его иммуногенной активности
Экспериментально обоснованы и разработаны оригинальные конструкции комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка, гепатита В (Бубо-М) и для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша, гепатита В (Бубо-Кок), защищенные патентами РФ № 2130779, № 2130778. На препараты оформлены Международные заявки № PCT/RU99/00266 (WO 00/06197. Опубл. 10.02.2000) и № PCT/RU99/00265 (WO 00/07623. Опубл. 17.02.2000)
Разработаны эффективные методические подходы и универсально стандартизированные схемы конструирования высокочувствительных ИФТС, предназначенных для определения антител различной специфичности, отвечающих по своим характеристикам требованиям ВОЗ, предъявляемым к наборам для иммунологических испытаний.
Впервые предложены иммуноферментные тест-системы (непрямой вариант ИФА), в которых в качестве антивидового конъюгата применены Р(аЬ)г-фрагменты аффинноочищенных антител сыворотки лошади против Ig G человека, меченные пероксидазой хрена, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность ИФА.
Впервые с применением оригинально сконструированных антигенных маркеров (анатоксины, меченные биотином) на основе авидин-биотинового взаимодействия разработана универсальная конструкция ИФТС для определения дифтерийного и столбнячного антитоксинов в сыворотках как людей, так и животных.
Впервые для определения анти-HBs предложена оригинальная конструкция, в которой рекомбинантный HBsAg подтип ayw применен для сорбции на твердой фазе и в составе конъюгата с биотином (Патент № 2206095 от 10.06.03 г.).
Впервые при оценке качества ИФТС использован метрологический подход, позволивший разработать эффективную методику количественного иммуноферментного определения специфических антител в международных единицах (МЕ/мл). На основании предлагаемого алгоритма обработки результатов ИФА разработана унифицированная компьютерная программа количественного определения антител различной специфичности.
Теоретическое и практическое значение работы Теоретическое значение работы определяется обоснованием рациональной методологии конструирования препаратов для диагностики и профилактики управляемых инфекций: сумма предложенных конструктивных подходов, технологических схем, а также систем обработки результатов экспериментов способна послужить универсальным инструктивным руководством при создании нового поколения комбинированных вакцин и иммуноферментных тест - систем.
Разработана технология производства первых отечественных комбинированных вакцин, содержащих гепатитный компонент (вакцина Бубо - М, Бубо -Кок) и оформлена нормативно-технологическая документация для их производства. Вакцина Бубо — М зарегистрирована в установленном порядке (Р № 000071 /01-20000 от 23.10.2000) и разрешена к промышленному выпуску и медицинскому применению.
Вакцина Бубо-Кок успешно прошла государственные испытания и рекомендована комитетом МИБП к регистрации в Российской Федерации (протокол № 1 от 27.02.03).
Безопасность, высокая иммунологическая активность вакцин Бубо-М и Бубо-Кок, не уступающая, а в большинстве случаев превосходящая используемые в настоящее время вакцины (АКДС, АДС-М, вакцина гепатита В), определяет их конкурентоспособность.
Разработана технология производства ИФТС для выявления дифтерийных, столбнячных и анти - HBs антител. Оформлена нормативно -техническая документация. Тест - система для выявления дифтерийных и столбнячных антител зарегистрирована в установленном порядке и разрешена к использованию в практике здравоохранения (Р № 94/90/10). С 1994 года начат производственный выпуск продукции. ИФТС для выявления анти - HBs антител прошла государственные испытания и находится в фазе регистрации.
Информативная ценность метода ИФА продемонстрирована эффективным применением 6 сконструированных ИФТС в реальной практике: оценки поствакцинального иммунитета у людей (непрямой вариант для выявления дифтерийных и столбнячных антител, авидин-биотиновый - анти-HBs); отбора плазмы доноров с высоким содержанием антител при производстве иммуноглобулинов (непрямой вариант ИФА); оценки иммуногенности вакцин на животных и определении титра антител гипериммунных антитоксических лошадиных сывороток (авидин-биотиновый вариант).
Положения, выносимые на защиту
1. Конструкции комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В (Бубо-М, Бубо-Кок), обеспечивающие напряженный иммунитет в отношении каждого составляющего компонента.
Технология изготовления комбинированных вакцин (Бубо-М, Бубо-Кок), обеспечивающая получение препаратов, соответствующих требованиям ВОЗ по иммуногенности, безвредности, стабильности при хранении.
Принципы конструирования и стандартизации высокочувствительных ИФТС для определения антител различной специфичности. Эффективная методика количественного иммуноферментного определения специфических антител.
Применение разработанных тест-систем для контроля эффективности вакцинации против дифтерии, столбняка и гепатита В, а также отбора плазмы доноров для производства специфических иммуноглобулинов.
КОМБИНИРОВАННЫЕ ВАКЦИНЫ: ИСТОРИЯ, ПРИНЦИПЫ
КОНСТРУИРОВАНИЯ И ПРОБЛЕМЫ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ИХ ПРИМЕНЕНИЯ (ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ)
Вакцинопрофилактика, ставшая неотъемлемой отраслью современного здравоохранения, является наиболее экономичным и доступным средством борьбы с инфекционными заболеваниями, а также важным компонентом достижения активного долголетия для всех социальных слоев населения развитых и развивающихся стран [322, 340]. Цели и задачи вакцинопрофилактики определяет Расширенная программа иммунизации (РПИ), принятая ВОЗ в 1974 году. В дальнейшем программа уточнялась и дополнялась, и к настоящему моменту принято выделять три этапа РПИ [80, 306]:
I этап (1974-1990 гг.). Цель РПИ-1 была сформулирована следующим об разом: существенное снижение в глобальном масштабе заболеваемости ко рью, полиомиелитом, дифтерией, коклюшем, туберкулезом и ликвидация на туральной оспы. В качестве средства достижения поставленных целей было рекомендовано вакцинировать не менее 80% детей первого года жизни. В це лом задачи РПИ-1 были выполнены, за исключением существенного сниже ния заболеваемости туберкулезом.
II этап (1991-2000 гг.). РПИ-2 предполагал решение двух глобальных за дач: во-первых, усиление контроля за 7 детскими инфекциями — перечень, оп ределенный РПИ-1, дополнен вирусным гепатитом В; во-вторых, планирова лось искоренение полиомиелита во всех странах мира, что, однако, не было выполнено.
III этап. Проект РПИ-3 находится сейчас в стадии обсуждения. Но уже очевидно, что он будет нацелен, прежде всего, на расширение числа инфекций, управляемых средствами иммунопрофилактики, и последовательное проведение международных программ по искоренению антропонозов.
От момента гениального опыта Э. Дженнера (1796 г) до ликвидации натуральной оспы на земном шаре (1978 г) прошло 180 лет, за которые разработаны вакцины против очень многих инфекционных заболеваний, часть из кото- рых используется для активной иммунизации в большинстве стран мира [10, 94].
Естественно, что такое развитие вакцинологии привело к существенному возрастанию количества прививок, получаемым каждым индивидуумом. На рис. 1. представлено число инъекций, получаемых детьми первого года жизни в развитых странах мира [268].
1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 1993 1995 2000 Рис. 1. Количество инъекций у детей первых двух лет жизни
Изменения в календаре прививок не могли не привести к появлению целого комплекса проблем: увеличивается риск инфицирования детей, в том числе и такими опасными возбудителями, как вирус гепатита В; вследствие необходимости контроля за большим количеством вакцин, возрастает возможность введения некачественного препарата; выполнение множества в той или иной степени болезненных процедур порождает проблемы морально-этического плана, в частности, во взаимоотношениях с родителями; возрастает нагрузка на медицинский персонал; - увеличивается стоимость программ иммунизации и, соответственно, снижается их экономическая эффективность [7,47,80,268,337].
Вместе с тем, отказ от выполнения программ иммунизации в полном объеме почти всегда приводил к резкому росту числа заболеваний, имевших минимальную распространенность или находившихся на грани ликвидации. Именно такая ситуация сложилась в 70-80 гг. с коклюшем сначала в Японии, а впоследствии в Германии, Англии и Шотландии [163,178,182]. Во всех этих случаях уровень заболеваемости приближался к довакцинному, общее число заболевших составило более 250 000 человек, а число летальных исходов достигло нескольких сотен.
Еще более драматическая ситуация сложилась в первой половине девяностых годов в России с заболеваемостью дифтерией [46,92,183,184,185Д 86, 341, 218]. К 1989 году уровень противодифтерийной иммунизации детей снизился до критического - ниже 50%. В результате только за 1994 г число заболевших превысило 39 000, в том числе почти 14 000 детей. При этом летальность среди непривитых детей до 3 лет составляла не менее 10%. После проведения широкой компании иммунизации уровень заболеваемости дифтерией удалось снизить к 1998 году практически в 30 раз - до 0,97 на 100 000 населения [94].
В целом, с одной стороны, мы в настоящее время имеем перегруженный календарь прививок, а с другой - фактическую невозможность уменьшения их числа до полной элиминации контролируемых ими инфекций.
Таким образом, в ближайшей перспективе мы не вправе ожидать снижения числа инфекций, подлежащих активной иммунопрофилактике. Более того, предполагается, что в первой половине наступившего века календарь профилактических прививок будет включать иммунизацию против 35-40 заболеваний [66,67].
Естественно, что проведение столь большого числа инъекций было бы не только крайне нежелательным, но и фактически невозможным. Поэтому наиболее реальным выходом из сложившейся ситуации представляется макси- мально широкое использование различных комбинаций вакцинных препаратов. Еще при принятии в 1990 г. второго варианта расширенной программы иммунизации, ВОЗ были сформулированы требования, предъявляемые к идеальной вакцине. Это должен быть препарат, содержащий все доступные компоненты в одной дозе, желательно вводимой перорально, температурно-резистентный, эффективный в ближайшее время после рождения и доступный для семей с разным материальным достатком [152]. Естественно, что создание подобной вакцины - дело достаточно отдаленного будущего.
Более реальной перспективой, по мнению ряда исследователей [16,93], могло бы стать создание двух базовых многокомпонентных вакцин. Одна из них должна основываться на базе АКДС с включением в нее трехвалентной полиовакцины, герпетической и вакцины против гепатита В, т.е. состоять из 8 компонентов. Рассматривается также возможность комбинации этого препарата с конъюгированной ///^-вакциной. Другой базовый препарат направлен против кори, паротита, краснухи и полиомиелита [17].
Следует отметить, что упрощенный вариант второй комбинированной вакцины - MMR, т.е. препарат для профилактики кори, краснухи и паротита используется в большинстве развитых стран достаточно давно (в частности, в США - с 1971 г.) и считается рутинным. В последнее десятилетие появилось также довольно много работ, посвященных комбинации MMR с вакциной против ветряной оспы [127, 144, 235,327], причем фирма Merck в настоящее время близка к завершению клинических испытаний и широкому внедрению этого препарата в практику [331,335].
Тем не менее, несмотря на интенсивные исследования, на сегодняшний день в мире не существует препаратов, приближающихся по своим характеристикам к первой из упомянутых базовых вакцин. Ещё более далека от совершенства ситуация с комбинированными вакцинами в России. Фактически к середине 2000 года, согласно документам Минздрава, к применению были разрешены лишь четыре препарата этого класса: АКДС, АДС-анатоксины, полиовакцина против трех типов вируса полиомиелита и менингококковая вакцина А+С [47,94]. При этом в нашей стране накоплен весьма ценный опыт в плане использования полианатоксинов - вакцинных препаратов, предназначенных для одновременной профилактики столбняка, ботулизма и газовой гангрены. Полианатоксины применялись в течение двух десятилетий и зарекомендовали себя в качестве эффективного средства специфической профилактики [3,18,30,31,42,50].
В то же время, с конца 1997 года официально разрешено одномоментное введение различных вакцин, что позволяет сократить количество визитов к врачу приблизительно на 20% [94]. Подобная практика одномоментной иммунизации применяется во многих зарубежных странах довольно давно, и ее результаты, как ближайшие, так и отдаленные, стали объектом значительного числа клинико-эпидемиологических исследований. По результатам имеющихся на сегодняшний день работ можно сделать вывод о том, что если вводимые вакцины не смешиваются в одном шприце (т.е. исключается их непосредственное физико-химическое взаимодействие), а также вводятся в различные участки тела, то доказательств взаимного подавления их эффективности не существует [160,187]. Также при совместном введении вакцин отмечено лишь крайне незначительное повышение числа осложнений по сравнению с изолированным применением наиболее реактогенной из них [160, 269].
Тем не менее, при одновременном введении различных вакцин не решается проблема сокращения количества инъекций, остаются актуальными вопросы транспортировки и хранения большого количества термолабильных препаратов, а также наличия всех показанных для единовременного применения вакцин. Поэтому основной линией современной иммунобиологической промышленности остаётся программа создания ассоциированных препаратов.
Естественно, что базисом для создания подобных препаратов могут стать, в первую очередь, уже достаточно давно существующие и проверенные практикой препараты. Одним из наиболее вероятных кандидатов на эту роль представляется коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорбированная вакцина (АКДС).
АКДС-вакцина и современные препараты на её основе
Первые комбинации, включавшие в себя дифтерийный и столбнячный анатоксины, были получены в конце 30-х годов после того, как была показана сравнительно низкая иммуногенность монопрепарата столбнячного анатоксина [195]. В дальнейшем была установлена возможность включения в этот препарат коклюшной вакцины, обладающей выраженными адъювантными свойствами [84], что значительно улучшило иммуногенную активность обоих анатоксинов по сравнению с использованием монопрепаратов [203]. Адсорбция анатоксинов алюмосодержащими препаратами также способствовала повышению их иммуногенности при одновременном снижении токсичности коклюшного компонента [305].
В нашей стране АКДС-вакцина начала использоваться с 1960 г. и уже к
1965 г. практически полностью вытеснила ранее применявшиеся монопрепа раты [126]. В некоторых странах аналогичная комбинированная вакцина на шла свое применение ещё раньше, например, в США - в 1948 г [78]. Состав этих препаратов может незначительно отличаться в зависимости как от стра ны-изготовителя, так и от конкретного производителя [161]. В России исполь зуется комбинация, содержащая 30 Lf (флокулирующих единиц) дифтерийно го анатоксина, 10 ЕС (единиц связывания) столбнячного анатоксина и 20 МОЕ (международных оптических единиц) коклюшной суспензии [89].
Внедрение АКДС-вакцины в клиническую практику оказало поистине революционное влияние на эпидемиологическую ситуацию в отношении контролируемых этим препаратом инфекций. Достаточно сказать, что с 1960 по
1966 годы, заболеваемость дифтерией снизилась почти в 1000 раз; коклюшем - в 40 раз; столбняком - в 20 раз [94]. В то же время, в нашем обзоре уже бы ли упомянуты драматические последствия резкого снижения широты охвата детского контингента прививками АКДС-вакцины в 80-х - начале 90-х годов, выразившиеся в резком росте заболеваемости дифтерией.
Поводом к этому послужили многочисленные публикации, как у нас в стране, так и за рубежом, преувеличивавшие риск возможных побочных реакций и осложнений при использовании АКДС [47, 132, 279]. В действительности же, как показала практика, последствия, возникающие в результате прекращения широкого использования этого препарата, во много раз превосходят возможный риск нежелательных эффектов при массовой иммунизации.
Тем не менее, проблема осложнений, связанных с применением АКДС действительно существует. По мнению многих авторов, после отмены проти-вооспенной иммунизации, именно АКДС-вакцина стала наиболее реактоген-ной в действующем календаре прививок [47,78,83, 139].
Естественно, поскольку существует проблема безопасности при использовании препаратов АКДС-вакцины, разрабатываются и пути её решения. Одной из наиболее вероятных перспектив представляется внедрение в практику бесклеточных вариантов коклюшного компонента.
Разработка бесклеточных коклюшных вакцин
Первые экспериментальные варианты ацеллюлярных коклюшных вакцин были предложены в начале 1970 годов одновременно в нескольких странах, в том числе и в Советском Союзе [77]. Предполагалось, что в состав подобного препарата должны войти обезвреженный коклюшный токсин и, возможно, ещё несколько компонентов, таких как филаментозный гемагглютинин, пер-тактин, фимбриальные агглютиногены, аденилатциклаза и т.д. [170,232,277].
Серьезные попытки внедрения бесклеточной противококлюшной вакцины в клиническую практику были начаты после серии вспышек коклюша в странах, ограничивших использование АКДС. Уже осенью 1981 г. в Японии была разрешена к использованию двухкомпонентная вакцина, включавшая лимфо-цитозстимулирующий фактор и филаментозный гемагглютинин (ФГА) [241,295]. Опыт почти двадцатилетнего применения этого препарата оказался достаточно успешным - за это время заболеваемость коклюшем снизилась по сравнению с эпохой корпускулярной вакцины более чем вдвое, а число ос- ложнений уменьшилось в 4-6 раз [241]. В дальнейшем японскими авторами был предложен ряд модификаций бесклеточной вакцины, и в настоящее время в этой стране используются два основных её варианта: JNIH-6 (уже упоминавшийся двухкомпонентный препарат) и JNIH-7 (монокомпонентный вариант, включающий только обезвреженный коклюшный токсин) [197]. Кроме того, в стадии клинических испытаний находится рекомбинантный препарат на основе участков ДНК, ответственных за синтез коклюшного и столбнячного токсинов внедренных в геном Е. coli [142].
Тем не менее, опыт экспериментального изучения ацеллюлярных проти-вококлюшных препаратов в большинстве стран Европы оказался не столь успешным. Так испытания JNIH-6 и JNIH-7 в Швеции, проводившиеся в конце 1980 гг. показали, что, хотя реактогенность этих вакцин была вдвое ниже по сравнению с корпускулярными, их иммуногенность оказалась явно недостаточной - соответственно 58 % и 41 % [250,278].
В последующие годы было предложено множество вариантов бесклеточных коклюшных вакцин. Только до заключительной стадии клинических испытаний были допущены препараты почти полутора десятков производителей [169, 299]. Представленные варианты различались между собой в значительно большей степени, чем традиционные корпускулярные противококлюшные препараты различных производителей. При этом, количество антигенов, входящих в их состав колебалось от 1 до 5 [115, 275, 310]. Обязательным компонентом всех вакцин был лишь обезвреженный коклюшный токсин.
Естественно, что основной целью разработчиков остаётся создание ацеллюлярных препаратов, предназначенных для включения в состав АКДС. В настоящее время известны результаты испытаний ряда таких комбинированных вакцин [157, 301, 325, 349], а некоторые из них рекомендованы для клинического применения. Так в США лицензированы четыре таких препарата, однако, все - лишь для использования в качестве четвертой (бустерной) дозы [177]. В Израиле АКДС с бесклеточным коклюшным компонентом также разрешена для бустерной иммунизации, а в некоторых европейских странах и в
Австралии аналогичные препараты применяются для полного цикла вакцинации наряду с цельноклеточными [143, 181].
Среди коммерчески доступных на сегодняшний день бесклеточных коклюшных вакцин наиболее известны следующие [94]: вакцина Takeda (Япония) - четырехкомпонентная, содержит 30-40 мкг ФГА, 5 мкг коклюшного анатоксина и 1 мкг пертактина и фимбриаль-ных агглютиногенов; вакцина Biken (Япония, Франция) - двухкомпонентная, содержит по 12,5-24 мкг ФГА и коклюшного анатоксина; вакцина Центра прикладных микробиологических исследований (CAMR, Великобритания) - трехкомпонентная, содержит по 10 мкг ФГА, коклюшного анатоксина и агглютиногенов;
Infanrix («SmithKline Beecham», Бельгия) - трехкомпонентная, содержит коклюшный анатоксин, ФГА и пертактин.
Несомненно, бесклеточные противококлюшные вакцины - это перспективные препараты. К их основным преимуществам, помимо более низкой ре-актогенности, относится возможность использования у подростков и взрослых [239, 290], что представляется весьма актуальным в связи с изменившейся эпидемиологией этой инфекции [212]. Но наряду с очевидными достоинствами, в применении ацеллюлярных вариантов вакцин существует ряд нерешенных вопросов. В частности, в условиях относительно невысокой заболеваемости коклюшем, представляется достаточно сложной прямая эпидемиологическая оценка их эффективности [289]. Поскольку для коклюша, в отличие от столбняка и дифтерии, не установлены защитные титры антител, лабораторные исследования качества вакцин также затруднены [115], а рутинный тест Kendrick [78] оценки цельноклеточных коклюшных вакцин во многих случаях неприменим при исследовании их ацеллюлярных аналогов [84]. Кроме того, определенное значение имеет и цена бесклеточных препаратов -примерно в 2-2,5 раза более высокая, чем у корпускулярных [314].
Таким образом, в настоящее время имеет место своего рода сосуществование традиционных вариантов АКДС и их бесклеточных аналогов. Фактически, лишь в Японии ацеллюлярная вакцина заняла основное место в профилактическом здравоохранении [294]. В других же странах, в том числе и в России, корпускулярный компонент, по-видимому, ещё в течение довольно длительного времени будет применяться, по крайней мере, для первичной вакцинации.
Итак, АКДС - это постоянно совершенствующийся препарат, имеющий достаточно долгую историю клинических наблюдений с хорошо изученными как положительными сторонами, так и возможными проблемными моментами, что делает вполне понятным его использование в качестве потенциальной основы для новых комбинированных вакцин.
Комбинированные вакцины АКДС/ИПВ
Интерес к комбинации в одном препарате АКДС и инактивированного препарата для профилактики полиомиелита впервые возник после появления живой оральной полиовакцины. В 1960 г Bordt D.E с соавторами провел сравнение раздельного введения АКДС и инактивированной полиовакцины и вакцины АКДС/ИПВ у 192 предварительно иммунизированных детей в возрасте от 1 месяца до 6 лет [141]. Результаты анализировались раздельно по возрастным группам: 1-5 месяцев; 6 месяцев-2 года; и дети старшего возраста. Для всех групп было показано, что введение комбинированной вакцины обеспечивало формирование более высокого уровня нейтрализующих антител против полиовируса, дифтерии и коклюша.
В особенности интерес к получению подобных препаратов возрос после разработки варианта инактивированной полиовакцины с повышенной активностью. Применение АКДС/ИПВ позволило бы упростить осуществление программ иммунизации и избежать необходимости транспортировки замороженных препаратов пероральных полиовакцин. Кроме того, исключалось перекрестное взаимодействие полиовирусов с дикими энтеровирусами в кишеч- нике, что часто встречается в тропических странах [307]. Элиминировался и риск развития вакцин-ассоциированного паралитического полиомиелита [221].
В 1980 году исследования, проведенные в Сенегале, продемонстрировали хорошую иммуногенность и эффективность комбинированной АКДС/ИПВ вакцины, представленной фирмой Мерье [307]. Тем не менее, сравнительное исследование показало, что при введении однократной дозы ИПВ, либо комбинаций ИПВ/коклюш, ИПВ/дифтерийный анатоксин, ИПВ/АКДС через месяц после иммунизации всех групп АКДС/ИПВ, уровень антител к полиови-русу был наименьшим именно в группе, получавшей АКДС/ИПВ [145].
В третьем исследовании, проведенном в Мали, 320 детей получали АКДС/ИПВ, использованную в предыдущих исследованиях, либо комбинации АКДС+ИПВ или АКДС+пероральная полиомиелитная вакцина [166]. Хотя во всех группах имела место стопроцентная сероконверсия в отношении всех трех штаммов полиовакцины, уровень антиполиовирусных антител в группе, получавшей комбинированную вакцину, был значимо ниже. При введении через год бустерной дозы, все группы давали превосходный антительный ответ в отношении полиовирусов, но средний титр антител опять-таки был вдвое ниже в группе, получавшей комбинированную вакцину. Однако пакистанские исследователи, сравнивавшие комбинации АКДС/ИПВ и АКДС+пероральная полиовакцина, обнаружили одинаково хороший иммунный ответ в обеих группах [284].
Ни в одной из упоминавшихся работ не было отмечено снижения титров антител к компонентам АКДС. Сравнительные исследования АКДС и АКДС/ИПВ в Скандинавии установили наличие роста уровня антительного ответа на АКДС в группе, получавшей комбинированную вакцину [292]. Ещё в одной работе было показано, что двукратное введение АКДС/ИПВ обеспечивает хороший антительный ответ на полиовирус и столбнячный анатоксин [291]. Уровень антител к дифтерийному анатоксину был ниже, но у 98 % детей он превышал защитный.
Первые достоверные данные о снижении гуморального иммунного ответа на коклюшный компонент вакцины АКДС/ИПВ были получены Baker и соавторами [130], сравнивавшими результаты вакцинации АКДС и ИПВ производства фирмы Пастер-Мерье Коннот по отдельности и в комбинированном виде. Неожиданно выяснилось, что одновременное использование АКДС и ИПВ в виде комбинированной вакцины или в форме двух различных инъекций приводит к формированию более низкого уровня антител к коклюшному компоненту, чем при введении комбинации АКДС+ИПВ в одном шприце.
В другом исследовании Halperin и соавторы показали, что одновременное, но раздельное введение АКДС+ИПВ обеспечивает более высокий уровень противококлюшных антител по сравнению с АКДС+ИПВ в одном шприце [216]. Данных об уровне антиполиовирусных антител в этих работах не приводилось, но другими исследователями было показано, что сероконверсия по* отношению к полиовирусам типов 1-3 при введении как АКДС/ИПВ, так и АКДС+ИПВ достигает 96-100% [255].
В целом было установлено, что антительный ответ на коклюшный и по-лиовирусные компоненты при применении вакцин типа АКДС/ИПВ может быть существенно более низким, чем при раздельном введении вакцин (АКДС+ИПВ). Тем не менее, сероконверсия в отношении всех компонентов комбинированной вакцины была полной, и уровень антител оставался достаточно высоким.
Важно, что увеличения частоты и тяжести побочных реакций не было отмечено ни в одном из исследований.
Еще одним вариантом комбинированных вакцин на основе АКДС стали комбинации с включением антигенов Haemophilus influenzae типа b (Hib).
Комбинированные вакцины АКДС/НіЬ
Широкое исследование вакцин, содержащих комбинацию АКДС/НіЬ (а иногда и их сочетания с ИПВ), было начато в конце 1980-х - начале 1990-х гг. В первом таком исследовании, выполненном в Израиле, сравнивалось раз- дельное и совместное введение вакцин АКДС и Act-Hib (PRP-T) производства фирмы Пастер-Мерье [330]. Увеличения частоты побочных реакций или снижения иммунного ответа на компоненты АКДС обнаружено не было. Хотя контрольная группа, получавшая только Act-Hib, отсутствовала, уровень антител к Haemophilus influenzae был сопоставим с данными, полученными при использовании этой вакцины ранее.
Канадские исследователи, сравнивавшие применение АКДС + PRP-T и АКДС/PRP-T, при использовании той и другой вакцины для бустер-иммунизации в возрасте 18 месяцев, также не обнаружили разницы в иммунном ответе на антигены Haemophilus influenzae, дифтерийный и столбнячный компоненты, но титр агглютинирующих противококлюшных антител был более низким при использовании комбинированной вакцины [297].
Возросший интерес к данным вакцинным комбинациям, вскоре обусловил проведение серии исследований в Чили и Канаде (Ванкувер). Оценивалась возможность комбинаций АКДС, Hib, ИПВ и пероральной полиомиелитной вакцины при парентеральном введении в различных комбинациях. Было показано, что использование комбинированной вакцины стимулировало значительно более слабый иммунный ответ ко всем антигенам, кроме дифтерийного анатоксина, по сравнению с раздельным введением компонентов [129, 154, 179,194,296].
Полученные результаты стимулировали дальнейшие исследования в этом направлении [136, 137, 238, 257, 259, 260]. Разница в титрах антител при совместном либо раздельном введении вакцин проявлялась непостоянно и находилась на пределе статистической достоверности. Для большинства антигенов было установлено, что титр специфических антител хотя и несколько снижался, но оставался значительно выше защитного уровня.
В ряде работ исследовалась также лиофилизированная PRP-T(Hib) вакцина, разводимая АКДС, а впоследствии был изготовлен аналогичный жидкий препарат (РЯР-Т(НіЬ)+АКДС). Сравнительное исследование не позволило установить различия в уровнях их иммуногенности и реактогенности [122].
Ни одна из комбинаций АКДС с Hib не приводила к существенному повышению частоты и тяжести побочных реакций.
Таким образом, комбинация АКДС+Hib показала свою эффективность и безопасность, и в настоящее время используется в календаре прививок нескольких стран: США (с 1993 года), Канада, Чили и др. [308].
Существуют и другие варианты комбинаций на основе АКДС, в частности, с противокоревой вакциной. Препарат может выпускаться как в лиофили-зированном виде, так и в виде раздельных лекарственных форм для смешивания в одном шприце [234, 302].
И все же особенно актуальными с точки зрения как нашего исследования, так и, возможно, практического здравоохранения в целом, представляются попытки создания вакцины на основе АКДС с включением в нее компонента со специфической направленностью против гепатита В.
Вакцины против гепатита В.
Особенности этиологии и эпидемиологии вирусного гепатита В
Вирусный гепатит В (HBV-инфекция) представляет собой острое воспаление печени, которое вызывается ДНК-содержащим вирусом диаметром 42 нм (частица Дейна), передающимся парентерально или перинатально от человека человеку. Заболевание чаще всего заканчивается выздоровлением, но в некоторых случаях может сопровождаться формированием длительного вирусоно-сительства и/или переходом в хронический гепатит и постгепатитный цирроз печени. При высокой концентрации вируса (более 10 вирусных частиц в 1 мл и более) минимальных следов крови (0,0001 мл) оказывается достаточно, чтобы вызвать острый вирусный гепатит В. При этом риск развития хронической формы тем выше, чем в более раннем возрасте произошло инфицирование, в частности, при заражении новорожденных от матери возможность хро-низации составляет до 90 % [43, 111,229,261,282].
Число носителей HBV в настоящее время в мире составляет по крайней мере 350 млн., а число летальных исходов превышает 250 тыс. в год [108].
Заболеваемость вирусным гепатитом В в России в последние годы находится на достаточно высоком уровне, несмотря на наблюдаемую в последние годы тенденцию к снижению (рис. 2).
45 40 55 30 25 20 15 10 5 О ^бтб- J33—5Т9"
1-> -ї
Рис. 2. Заболеваемость вирусным гепатитом В в Российской Федерации 1992-2002 г. на 100 тыс. населения [59].
Число носителей гепатита В в России превышает 5 млн. человек и составляет около 3,5 % от всей популяции. При этом, по критериям ВОЗ, уровень носительства 1-2 % считается средним, а 5 % и более - высоким [111, 313].
Безусловно, помимо эпидемиологических факторов, значительную роль в распространении инфекции играют особенности вызывающего её патогенного агента. Структура рассматриваемого вируса уникальна и не имеет аналогов у других возбудителей заболевания человека. В то же время, сходное строение имеют патогены, вызывающие поражения печени у сурков, уток, белок и других животных [43, 256. 312].
Морфологически частицы вируса гепатита В, циркулирующие в крови больных разделяются на 3 типа: филаментозные структуры диаметром около 22 нм и длиной 50-230 нм, не проявляющие инфекционных свойств; сферические тельца со средним поперечным размером 22 нм;
3) собственно частицы Дейна - единственные формы, обладающие ДНК, ДНК-зависимой ДНК-полимеразой и набором специфических антигенов. Морфологически представлены двухслойными сферическими образованиями диаметром около 42 нм. Схематическое изображение частицы Дейна представлено на рис. 3.
Геном возбудителя образует неполная (с разрывом одной цепи) кольцевая двухнитевая молекула ДНК. В состав нуклеокапсида входит также сердцевинный антиген или HBcorAg, представляющий собой один из маркеров заражения HBV-инфекцией.
Однако более важным с точки зрения как патогенеза, так и диагностики инфекции считается локализованный в наружной оболочке белок - так называемый HBsAg. Этот протеин идентичен фрагменту, выделенному в 1965 г. Blumberg из крови австралийских аборигенов и длительное время носившему название «австралийский антиген». HBsAg имеет четыре самостоятельных подтипа - ayw, ayr, adw и adr, смешанные субтипы встречаются крайне редко. HBsAg часто образует дефектные частицы, лишенные инфекционных свойств - побочные продукты репликативного цикла. Антиген постоянно циркулирует в сыворотке крови зараженных людей. В его состав входят два полипептидных фрагмента:
Полипептид preSi, обладающий выраженными антигенными свойствами и представляющий собой важнейший компонент генно-инженерных вакцин. Считается, что ещё одной функцией региона preSi может быть регулирование секреции HBsAg;
Полипептид preS2, - глобулиновый рецептор, обеспечивающий адсорбцию на гепатоцитах, и тем самым играющий одну из ведущих ролей в патогенезе инфекции.
Функции третьего важнейшего антигена возбудителя вирусного гепатита В - HBeAg неизвестны, но именно он признается наиболее чувствительным диагностическим показателем активной вирусной инфекции.
Иммунопрофилактика вирусного гепатита В
Разработка методов иммунопрофилактики HBV-инфекции началась вскоре после открытия возбудителя этого заболевания и установления его антигенной структуры. В настоящее время в ряде стран выпускаются как гипериммунные сыворотки, так и иммуноглобулины с анти-HBs направленностью [43]. В России зарегистрирован единственный иммуноглобулиновый препарат со специфической направленностью против вирусного гепатита В - «Анти-геп», разработанный НПО «Биомед» совместно с НПК «Комбиотех» [63].
Что касается средств активной иммунопрофилактики вирусного гепатита В, то история их использования началась в начале 80-х гг. с так называемых «плазменных вакцин», получаемых из сывороток крови носителей с высоким уровнем содержания HBsAg.
Плазменные вакцины использовались довольно широко: так по данным ВОЗ, к 1990 году общее число лиц, подвергшихся активной противогепатит-ной профилактике превысило 1 млн. человек. Эффективность вакцин составляла не менее 85-90 %, и именно тогда впервые была поставлена задача полной ликвидации HBV-инфекции [83, 228]. Тем не менее, действительно полномасштабное использование противогепатитных вакцин первого поколения сдерживалось рядом факторов. В частности, применение человеческой плазмы в качестве исходного сырья определяло достаточно высокую цену коммерческих продуктов, а их производство было доступно лишь относительно крупным предприятиям. Кроме того, существовали опасения в связи с потенциальной возможностью заражения реципиентов вакцин такими заболеваниями, как СПИД, или, что более обосновано, прионными инфекциями [124]. Так или иначе, во многих странах, в том числе и в России, ни одна из плазменных вакцин так и не была разрешена к клиническому применению.
Новые возможности создания эффективных и доступных по цене вакцин появились в связи с развитием методов генной инженерии. Во второй половине 80-х гг. была показана возможность получения белков, идентичных по своим иммуногенным свойствам HBsAg в различных системах - в клетках Escherichia coli, вирусе осповакцины, аденовирусах, бакуловирусах, клетках млекопитающих. Однако единственным источником рекомбинантных препаратов против гепатита В, зарегистрированным как в России, так и в других странах остаются дрожжевые клетки [94].
Схема получения рекомбинантного HBsAg включает разрушение клеток субстрата 8 М мочевиной или при помощи гомогенизации с последующей многоэтапной хроматографической очисткой. Вакцины сорбируются на геле гидроокиси алюминия и содержат мертиолят в качестве консерванта [94].
Несмотря на высокую степень гомогенности, рекомбинантный HBsAg содержит несколько детерминант, вызывающих образование антител определенной специфичности. Детерминанты имеют пептидную природу и состоят из 10-12 аминокислотных остатков. По-видимому, полученные в очищенном виде, эти эпитопы могут стать основой нового класса препаратов - синтетических пептидных вакцин [48].
Разработка первой отечественной рекомбинантной вакцины против гепатита В была осуществлена НПК «Комбиотех» (г. Москва). В настоящее время вакцина внесена в Государственный реестр лекарственных средств и включена в календарь прививок. Вакцина выпускается в двух вариантах: по 1 мл с содержанием HBsAg 20 мкг (взрослая доза) и 0,5 мл с содержанием HBsAg 10 мкг (детская доза). В качестве консерванта используется мертиолят в концентрации 0,005 %. Срок годности вакцины составляет 3 года. По своим характеристикам она соответствует требованиям ВОЗ и не уступает зарубежным аналогам, зарегистрированным на Российском рынке. Сравнительная характеристика этих препаратов и вакцины производства НПК «Комбиотех» приведена в табл. 1.
Таблица 1 Сравнительная характеристика основных показателей рекомбинантных вакцин против гепатита В [94]
Схемы применения вакцины «Комбиотех» аналогичны схемам для зарубежных вакцин: 0-1-2 мес. - экстренная и 0-1-6 мес. - стандартная [89].
В целом, по данным различных источников, все зарегистрированные в России вакцины обладают примерно одинаковой эффективностью, обеспечивая сероконверсию на уровне 92,3-100 % при уровне специфических антител не ниже 10 мМЕ/мл [108, 124]. Однако из опыта государств, применяющих вакцину против HBV-инфекции в течение более или менее длительного времени, можно сделать вывод о том, что значительное снижение заболеваемости и носительства HBV возможно лишь при массовой иммунизации: т.е. когда в соответствии с рекомендациями ВОЗ вакцинируются не только «группы риска», но и все новорожденные и дети подросткового возраста [ПО]. Осложнения и побочные эффекты при использовании современных вакцин против гепатита В встречаются редко, и в большинстве случаев обусловлены наличием в препаратах остаточных количеств дрожжевых компонентов [90, 311].
Таким образом, рекомбинантные вакцины против гепатита В за время своего почти двадцатилетнего применения зарекомендовали себя в качестве весьма эффективного и безопасного средства активной иммунопрофилактики, что, в сочетании с гибким календарем прививок и их доступностью в самом раннем возрасте не могло не сделать их кандидатами для включения в комбинированные препараты.
Комбинированные вакцины с включением рекомбинантного HBsAg
Комбинации, содержащие HBsAg и Hib . В США и некоторых европейских странах лицензирована вакцина Comvax производства фирмы Merck, содержащая комбинацию HBsAg (5 мкг) и конъюгированной PRP/OMP Hib-вакцины (7,5 мкг). Исследования, посвященные сравнению эффективности Comvax и раздельного введения его компонентов (оба препарата вводились в возрасте 2, 4 и от 12 до 15 месяцев) не позволили обнаружить существенной разницы в антительном ответе [332]. Средний уровень антител против Н. Influenzae при использовании комбинированного препарата и при раздельном введении компонентов составил 2,5 и 2,8 мкг/мл соответственно, а процент детей, имеющих их содержание выше 1,0 мкг/мл составил 72 % и 76 %. При использовании бустерной дозы в возрасте от 12 до 15 месяцев показатели антительного ответа увеличивались до 9,5 и 10,2 мкг/мл и 92 % и 93 % соответственно. Ответ на HBsAg также оказался сравнимым в обеих группах - 92 % и 98 % обследованных в соответствующих группах имели защитный уровень антител (>10 мМЕ/мл) в возрасте 6 месяцев и 98 % и 100 % после введения бустерной дозы.
Комбинации НВ/НА. Вакцины для профилактики одновременно гепатита А и В разрабатываются параллельно в нескольких странах, в том числе и в России [94]. В одной из доступных нам работ авторы сравнивали введение комбинации вакцин Havrix 720 (против гепатита А) и Engerix - В (20 мкг) детям в возрасте 0, 1 и 6 месяцев с теми же вакцинами, вводимыми раздельно или смешиваемыми во время вакцинации [120]. Антительный ответ на оба антигена при использовании комбинированной вакцины был достаточно высоким - протективный уровень достигался у 100 % реципиентов уже перед третьей вакцинацией. В аналогичном исследовании на взрослом контингенте были показаны сходные результаты [247].
Таким образом, рекомбинантная вакцина против HBV-инфекции удачно зарекомендовала себя в качестве компонента комбинированных вакцин, а возможность варьирования сроков её введения позволило расширить круг потенциальных комбинаций.
Разработка комбинированных вакцин на основе сочетания АКДС и НВ
Как уже было отмечено выше, в настоящее время идёт интенсивный поиск в области усовершенствования многих традиционно применяемых вакцин, в том числе и АКДС. В первую очередь, по-видимому, это касается тенденции к замене корпускулярного коклюшного компонента этого препарата бесклеточным. Поскольку этот процесс, хотя и развивающийся интенсивно, ещё далек от завершения, в данном фрагменте нашего обзора мы будем рас- сматривать комбинации HBsAg как с традиционной АКДС-вакциной, так и с её аналогами, включающими бесклеточный коклюшный компонент (АбКДС).
Комбинированные вакцины АКДС/НВ
Первые разработки препаратов, содержащих в своем составе АКДС, НВ-вакцину, а затем и конъюгированную вакцину против Hib, проводились в 1993-1997 гг. одновременно несколькими группами исследователей [138,269, 288,321,338]. В одной из работ [138] применялся компонент Act-Hib (PRP-T), изготовленный фирмой «Пастер-Мерье Коннот», в остальных - производства «СмитКляйн Бичем» (Hiberix). Прочие компоненты всех вакцин были изготовлены фирмой «СмитКляйн Бичем».
Опубликованные результаты оказались весьма вариабельными. Одни и те же комбинированные вакцины обладали по разным данным как более высокой, так и более низкой специфической активностью. В целом, даже в тех исследованиях, где эффективность вакцин оказалась наименьшей, уровень специфических антител был значительно выше защитного.
В частности, J. Diez-Delgado и соавторы показали, что введение противо-гепатитного компонента практически не оказывало влияния на уровень антительного ответа против дифтерии, столбняка и коклюша. Сероконверсия же в отношении HBsAg составляла 100% при среднем уровне антител 2318 мМЕ/мл. Различий в уровне побочных реакций на вакцины с включением HBsAg или без такового обнаружить также не удалось [162].
Авторы другой работы [161] оценивали эффект использования бустерной дозы АКДС/HB/Hib, вводимой в возрасте 18 месяцев детям, предварительно вакцинированным АКДС/HB/Hib либо АКДС/HB+Hib. Обе группы продемонстрировали хороший антительный ответ. В целом, он был несколько выше в группе, получавшей в качестве первой прививки АКДС/HB/Hib, в особенности это касалось антител к PRP (компонент Hib).
Также оценивалась эффективность австралийской АКДС с включением НВ и Hib - компонентов производства фирмы «Мерк» (Австрия). Было по- казано, что при использовании этой вакцины в качестве бустера, имел место хороший антительный ответ на все компоненты вакцины, хотя в отношении Hib-компонента он и уступал моновакцине [265].
В целом, суммируя результаты различных групп исследователей, можно прийти к выводу о том, что включение HBsAg в вакцину АКДС не снижает уровня гуморального иммунного ответа на её компоненты. Однако, если одновременно проводится иммунизация против Haemophilus influenza, или Hib-компонент вводится в состав препарата, снижения уровня антител к нему можно ожидать с высокой долей вероятности [161].
Комбинированные вакцины АбКДС/НВ
В 1993-96 годах, в рамках мультицентрового исследования, проводившегося в Италии с целью оценки возможности введения в практику здравоохранения ацеллюлярных коклюшных вакцин, была проведена оценка возможности совместного использования АКДС с корпускулярным или бесклеточным коклюшным компонентом и рекомбинантной вакцины против гепатита В. Исследуемую группу составили 1237 детей из 15601, включенных в эксперимент. Вакцинацию выполняли в 2, 4 и 12 месяцев с использованием одной цельноклеточной вакцины производства США и трех бесклеточных, производимых в Европе. Иммуногенность гепатитного компонента оценивали методом ИФА по уровню специфических антител через 9 месяцев после его последнего введения. Только у 13 детей уровень специфических антител оказался ниже протективного (10 мМЕ/мл), причем разницы между группами, получавшими разные препараты, по этому показателю установлено не было [293].
В ряде параллельных исследований были показаны сходные результаты [125,191,236], и в 1997 году в Европе была лицензирована комбинированная вакцина производства «СмитКляйн Бичем», содержащая АбКДС/НВ. Применение комбинированной вакцины при различных схемах введения не снижало иммуногенности и безопасности ее составляющих. Введение препарата в 2, 4 и 6 месяцев позволяло обеспечить более высокий уровень антител по сравнению с рекомендованной в США схемой (НВ сразу после рождения, в 1 и 6 месяцев; АбКДС в 2,4 и 6 месяцев) для всех компонентов, кроме HBsAg [201]. Но и по отношению к HBsAg средний уровень антител был высоким (1280 мМЕ/мл), причем 98 % детей имели содержание антител выше протективного уровня (10 мМЕ/мл).
Комбинации, включающие ЛбКДС/НВ/НіЬ
Известно достаточно много работ, посвященных оценке комбинированной вакцины АбКДС/HB/Hib производства фирмы «СмитКляйн Бичем». Как и в случае использования корпускулярного коклюшного компонента, применение этой вакцины приводило к формированию несколько более низкого гуморального ответа на Hib, чем при раздельном введении вакцин.
Например, группы детей, получавшие в 2, 4 и 6 месяцев АбКДС/НВ/НіЬ (1), АбКДС/НВ+НіЬ (2) или АбКДС+НВ+НіЬ (3) имели уровень антител к Hib в 7 месяцев на уровне 1,5; 6,9 и 6,4 мкг/мл соответственно; при этом процент имеющих уровень антител выше 1,0 мкг/мл составлял 68 %, 91 % и 90 % [201, 202]. В отношении остальных компонентов интерференции не наблюдалось* Дети, имевшие в 7 месяцев уровень антител ниже 1,0 мкг/мл в возрасте от 11 до 15 месяцев получали бустерную дозу вакцины, после чего уровень антител к Hib в группе, получавшей комбинированную вакцину повышался до 5,1 мкг/мл, против 3,0 мкг/мл среди получавших монопрепараты [202].
Другое исследование также показало одинаковый уровень иммунного ответа на все компоненты вакцины, кроме Hib. Содержание анти-Hib антител составляло 1,2 и 5,5 мкг/мл, а процент детей, имеющих содержание антител свыше 1 мкг/мл - 58 % и 88 % соответственно [274]. У детей, имевших низкий иммунный ответ на первичное введение вакцины, бустер-иммунизация приводила к образованию достаточного уровня антител.
Аналогичные результаты в отношении Hib-компонента были получены в исследовании, проведенном в Германии. Детей иммунизировали в возрасте 3,
4 и 5 месяцев. Средний уровень антител к Hib составил 1,2 мкг/мл и 5,5 мкг/мл соответственно для групп, которым вводили АбКДС/HB/Hib и АбКДС/НВ+НіЬ [298]. Fred Zepp и соавторы ревакцинировали детей первой из этих групп в возрасте 12 месяцев. После бустер-вакцинации антительный ответ был весьма высоким, что говорит о хорошем примировании иммунной системы комбинированной вакциной [348].
Комбинации АбКДС/НіЬ/ИПВ/НВ
Исследования вакцинных комбинаций на основе АбКДС, включающих в свой состав пять и более компонентов, были начаты в первой половине 1990-х годов. Наиболее распространенная лекарственная форма для подобных препаратов на сегодняшний день представляет собой жидкую вакцину АКДС с включением инактивированного полиомиелитного компонента и иногда HBsAg. Hib-компонент, как правило, поставляется в отдельной таре в лиофи-лизированном виде и растворяется ex tempore [237].
В отношении исследования содержания антител к возбудителям полиомиелита и Н. influenzae контрольными препаратами служат, как правило, соответствующие монопрепараты, а для полиомиелита дополнительным показателем сравнения может служить и уровень гуморального ответа на перораль-ную живую либо инактивированную полиовакцину [320].
По имеющимся к настоящему времени литературным данным можно сделать вывод о том, что рассматриваемые комбинации обеспечивают достаточно высокую степень защиты против всех компонентов, причем содержание антител к столбнячному, дифтерийному анатоксинам и В. pertussis часто оказывается более высоким, чем в случае применения традиционных вакцин [180]. В то же время, уровень гуморального ответа против Hib и полиовирусов был хотя и достаточным, но несколько уступал таковому при раздельном введении препаратов [161].
Таким образом, опыт, накопленный в области применения комбинированных вакцин с включением HBsAg, демонстрирует, что сочетания последнего с компонентами АКДС-вакцины позволяют обеспечить достаточно высокий уровень специфических антител против всех компонентов, включенных в препарат. В то же время, имеет место некоторое снижение гуморального иммунного ответа против полиовирусов и Н. influenzae, что, по-видимому, не позволяет однозначно рекомендовать их для включения в комбинированные препараты на базе АКДС.
Таким образом, из представленных данных видно, что за рубежом ведутся интенсивные разработки по созданию новых комбинированных вакцин. О том, насколько актуален этот вопрос, можно составить представление из приведенных ниже таблиц (табл. 2, 3). В первой из них отражено современное состояние разработки новых комбинированных вакцин.
В табл. 2 отсутствуют данные по наиболее широко распространенным, по сути своей рутинным, препаратам, таким, как АДС, АКДС (в том числе и с бесклеточным коклюшным компонентом), полиовакцины, вакцины типа корь-паротит-краснуха.
Некоторые из упомянутых в предыдущей таблице вакцин уже коммерчески доступны и используются во многих странах. В частности, в табл. 3 приведены данные по комбинированным вакцинам, разрешенным к применению на данный момент в США.
Анализ данных, приведенных в табл. 3, позволяет убедиться, что существует весьма значительное число комбинированных вакцин, направленных против одних и тех же заболеваний, но отличающихся количественным содержанием антигенов. Это касается как проверенных временем препаратов (таких как АДС-анатоксины или АКДС), так и комбинаций, включающих в себя новые иммунизирующие агенты.
Следует отметить, что разработка комбинированных вакцин и их оценка -достаточно сложная задача. Поэтому представляется необходимым указать ряд проблемных моментов, возникающих при создании комбинированных вакцин.
Таблица 2
Комбинации
Клинические Разработки испытания PMC-US, WL Merck PMC-US NAVA WL PMC-Fr, PMC-US, SB Merck Merck, SB
Комбинированные вакцины для иммунизации младенцев и детей лицензированные и исследуемые [161] Обладатель лицензии *АбКДС - АКДС с бесклеточным коклюшным компонентом.
Названия фирм, упомянутых в таблице: NAVA - North American Vaccine; PMC Pasteur Merieux Connaught; SB SmithKline Beecham; WL Wyeth Lederle Vaccines and Pediatrics.
Таблица З
Комбинированные вакцины доступные в настоящее время в США [161]
Проблемы создания комбинированных вакцин
В разработке и применении многокомпонентных вакцин имеются трудности, среди которых можно отметить следующее: - химическое или физическое взаимодействие между компонентами вакцины может привести к нарушениям иммунного ответа на них. Такие адьюван-ты, как гидроксид или фосфат алюминия связываются с инактивирован-ными вакцинами при помощи нековалентной ионной связи. Введение в состав вакцин, обычно применяемых с адъювантами, дополнительных компонентов, может приводить к химическим взаимодействиям и снижению эффективности первичной вакцины. Кроме того, вследствие подобного взаимодействия может изменяться иммунный ответ и на вторую вакцину [230]. буферные растворы, стабилизаторы и другие подобные компоненты, включаемые в одну из вакцин, могут взаимодействовать с фрагментами другой вакцины. Например, некоторые АКДС и Hib вакцины содержат мертиолят, способный инактивировать убитую полиовакцину. Хотя эти вакцины не объединяют в одном препарате, их соединение в одном двухкамерном шприце, может привести к серьезным проблемам [145]. недостаточная стабильность сложных комбинаций из антигенов [124,230]. возможность конкуренции и интерференции антигенных компонентов вакцины. Живые вакцины могут иммунологически интерферировать, снижая эффективность друг друга. [50]. лабораторный контроль комплексных вакцин сложнее, чем контроль моновакцин. Возможны большие материальные потери в случае производственного или рекламационного брака одного из компонентов [123]. экспериментальные разработки и клинические испытания комплексных вакци н трудоемки, длительны и дорогостоящи [161]. - наконец, патентная документация и другие специальные издания также за частую затрудняют производство комбинированных вакцин. Производите ли вакцин не могут продавать препараты, содержащие компоненты, на ко- торые они не имеют лицензии. Наилучшим выходом во многих случаях мог бы стать совместный выпуск комбинированных препаратов различными производителями, но это осложняется отсутствием согласия между компаниями. В последние годы консолидация производителей и практика кросс-лицензирования несколько снизили остроту проблемы, но до полного ее разрешения еще далеко [161, 196]. Подбор «лабораторных эквивалентов» вакцинации представляется серьезной проблемой. В отношении некоторых антигенов установлена строгая иммунологическая корреляция между уровнем антител и клинической защитой. Подобные эквиваленты были определены в отношении многих компонентов широко распространенных вакцин: дифтерийного анатоксина, HBsAg, Hib, вируса кори, полиовируса и столбнячного анатоксина. Исследования ряда других вакцин, например, коклюшных, не позволили установить такой корреляции.
Нахождение подобных эквивалентов может принести значительную пользу. В частности, оно позволит сфокусировать внимание на лабораторных данных, имеющих непосредственное клиническое значение взамен статистически достоверных, но клинически мало значимых отклонений. Если использование антигена в составе комбинированной вакцины приводит к снижению антител к нему по сравнению с контролем (моновакцина), но, тем не менее, уровень антител остается значимо выше протективного, то подобная комбинированная вакцина обладает несомненной клинической значимостью [159, 160,337].
Кроме того, использование иммунологических коррелятов может упростить процесс лицензирования новых вакцин - в том случае, если имеется возможность сравнения иммунологических показателей исследуемой вакцины с существующими ранее. Также наличие коррелятов для одних антигенов может облегчить процесс их нахождения для других.
Отсутствие коррелятов приводит к проблемам, с лицензированием новых вакцин, и вынуждает использовать все более сложные методы их оценки в надежде найти такие эквиваленты [161].
Таким образом, соединение множества антигенов в одном инъекционном препарате требует доказательства того, что подобная комбинация не снижает безопасности вакцинирования, иммунологической эффективности компонентов [159,167,168].
Испытания комбинированных вакцин должны проходить с использованием контролируемых, рандомизированных слепых методов с обязательным наличием контрольных групп. Подбор групп сравнения в случае исследования многокомпонентных вакцин может быть весьма затруднителен. В случае отсутствия предварительных данных о совместимости компонентов, для того, чтобы изучить, не снижается ли иммуногенность каждого из п компонентов вакцины, рекомендуется провести исследование на 2П группах, изучаемых отдельно. При этом некоторые дополнительные факторы могут потребовать значительного увеличения числа групп сравнения [161].
Например, последовательность введения тех или иных компонентов может влиять на их иммуногенность. В частности, было показано, что иммунный ответ на некоторые Hib-содержащие вакцины может зависеть от предшествующего или параллельного введения АКДС. Оценка подобного взаимодействия требует исследования с вовлечением групп реципиентов, каждая из которых получает исследуемые антигены в разных последовательностях [296].
Дополнительным фактором, осложняющим ситуацию, представляется тот момент, что снижение антительного ответа на один из компонентов может возникнуть, в одних случаях при одновременном введении иммуногенов даже в различные участки тела, в других же случаях подобное явление возникает именно при смешивании ингредиентов в одном шприце и их физическом или химическом взаимодействии. Необходимость дифференциации подобных проблем приводит к введению дополнительных групп наблюдения.
Еще одним узким местом становятся этические проблемы. К примеру, вакцины, предназначенные для рутинного применения и обязательные к использованию, могут интерферировать с компонентами исследуемых вакцин [297].
Сложность исследования повышается и вследствие доступности большого числа вакцин против одного и того же патогена. Так, к примеру, уже лицензированы 3 Hib, две НВ и семь бесклеточных коклюшных вакцин. Следовательно, существует 42 возможных комбинации АбКДС/ Hib/ НВ вакцин. Каждая такая комбинация будет уникальна, и нет уверенности в том, что отдельные ее компоненты, включенные в другую вакцину, будут в ней достаточно иммуногенны [161]
По-видимому, наиболее эффективным решением этой проблемы мог бы стать подход, предложенный Американским Национальным институтом здравоохранения. Суть его такова: если имеется достаточный базис для исследования многокомпонентной вакцины (т.е. если изучена комбинированная вакцина, отличающаяся от предлагаемой только отсутствием одного компонента), исследователи вправе сравнить новую вакцину с комбинацией (вакцина-предшественник + новый компонент, вводимый раздельно). Другой возможностью представляется сравнение новой вакцины со всеми ее компонентами, вводимыми одновременно, но раздельно. При этом приходится пренебрегать исследованием субкомбинаций, в надежде на отсутствие интерференции. Также в целях упрощения исследования комбинированных вакцин представляется возможным использование в одной из групп сравнения ранее исследованной аналогичной вакцины. Результаты представляются правомерными для сравнения, если в этой группе сравнения будут получены результаты, близкие к наблюдавшимся в предшествующих исследованиях. Подобная техника («бриджинг») была использована в широко известном Шведско-Итальянском исследовании, ставшем своего рода современным стандартом изучения свойств комбинированных вакцинных препаратов [199,213]. Методологический риск при подобном подходе может быть снижен путем приложения определенных усилий для обеспечения корреляции серологических и клинических данных между разными группами исследователей. При этом очень важно, чтобы оценка иммунологической эффективности комбинированных вакцин проводилась стандартными методами. Об актуальности этой проблемы свидетельствует создание Европейской Комиссии (ESEN) по координации и гармонизации серологических методов контроля эффективности иммунопрофилактики [328].
Проблемы иммунодиагностики управляемых инфекций
Успех программ вакцинопрофилактики в значительной мере определяется наличием средств и методов иммунодиагностики. Последние имеют важное значение не только для диагностики заболеваний, но также для определения иммунного статуса населения и оценки качества профилактических препаратов.
Вакцина считается высокоэффективной, если процент сероконверсии (появление антител или трехкратное увеличение их титров) составляет 90 % и выше. Для многих инфекций определен защитный титр антител, обеспечивающих устойчивость к заражению у большинства привитых (табл. 4). При этом следует отметить, что титры ниже защитного могут играть существенную роль в противоинфекционной резистентности, а высокие титры антител не являются абсолютной гарантией защиты [50].
Таблица 4
Защитные и максимальные титры антител у привитых [49 ].
Методы определения антител
В настоящее время серологический скрининг является основным инструментом для объективной оценки состояний иммунитета, возникающих в процессе инфекции или вакцинации [48, 59, 96].
В практике для определения напряженности иммунитета применяется ряд тестов: реакция нейтрализации (РН) токсина на животных, реакция связывания комплемента (РСК), латексной агглютинации, коагглютинации, им-мунофлюоресценции, реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) [33, 36, 38, 78, 86, 276]. Применение РН (классического метода определения антитоксинов) в эпидемиологической практике ограничено в связи со сложностью выполнения, длительностью получения результатов и необходимостью использования большого количества лабораторных животных. Основным недостатком остальных вышеперечисленных методов является невысокая точность и значительный элемент субъективизма, связанного с тем, что, как правило, нелегко отличить с достаточной надежностью слабую положительную реакцию от отрицательной [36]. Кроме того, ни один из перечисленных тестов не поддается автоматизации учета результатов. Выгодно отличаются в этом плане серологические методы «второго поколения», в частности иммунофер-ментного анализа (ИФА) [323].
Иммуноферментный метод впервые был применен в гистохимии [29], а затем после опубликования ряда работ стал широко использоваться для определения различных физиологически активных веществ [25, 28]. Благодаря использованию ИФА сделан крупный шаг вперед в развитии различных направлений научной и практической медицины [8, 9, 12, 35, 45, 91, 114, 249, 251].
Трудоемкие, длительные и дорогостоящие методы диагностики вирусных и бактериальных инфекций оказалось возможным заменить экспрессными, количественными и более чувствительными методами ИФА.
Наиболее ярким примером является разработка методов дифференциальной диагностики гепатита, а также создание надежных методов защиты банков донорской крови от вирусных антигенов [8, 200]. Большие перспективы открывает ИФА в области контроля за иммунопрофилактикой.
Самым распространенным методом определения антител является непрямой твердофазный метод ИФА, так называемый метод двойных антител, предложенный Е. Engvall, Perlmann [171,172,173].
Антитела, связавшиеся с антигеном, фиксированным на твердой фазе, выявляют с помощью комплементарных им «вторых» противовидовых антител, конъюгированных с ферментом. В данном варианте один антииммуног-лобулиновый (противовидовой) конъюгат также может применяться для определения самых различных антител. Например, для определения любых антител в сыворотке людей необходим один конъюгат - меченные ферментом антитела против человеческого иммуноглобулина [227].
В литературе имеется большое количество работ с применением непрямого метода для определения антител при различных инфекционных заболеваниях: стафилококковых инфекциях [13, 14, 147, 153, 231, 333, 326], дифтерии [6, 34, 40, 146, 206, 207, 208, 209, 210, 211], столбняке [106, 112, 121, 146, 165], стрептококковых инфекциях [39, 133, 134], коклюше [79, 104, 158, 198, 217, 316, 334, 347], хламидиозах [26, 246], сальмонеллезах [4, 283], менинго-кокковых инфекциях [32, 68, 81], гепатитах [5, 200, 272] и др. При анализе результатов авторы отмечают большую чувствительность и специфичность метода по сравнению с другими, применяемыми в широкой практике, и пригодность его для полевых условий.
Однако системы с антивидовыми конъюгатами имеют и свои недостатки. В частности, это неспецифические взаимодействия, которые могут иметь место между энзиммеченным антиглобулином и гетерологичным иммуноглобулином, присутствующим в клиническом образце, либо с антителом, фиксированным на твердой фазе. Неспецифические реакции такого рода в значительной степени исключаются при использовании систем, в которых применяют гаптены, связанные со вторым антителом или антигеном. При этом реакция заканчивается с помощью иммунореактантов, способных эффективно связываться с этим гаптеном [345].
Среди систем, включающих гаптен-антигаптен, особой чувствительностью отличается авидин (стрептавидин)-биотиновая [204, 240, 252, 344]. В такой системе иммуноглобулин или антиген ковалентно связывается с биоти-ном, реакция проявляется конъюгатом авидина (стрептавидина) с ферментом. Основное преимущество указанной реакции обусловлено чрезвычайно высокой аффинностью авидина по отношению к биотину, более чем в миллион раз превосходящую константу ассоциации антигена с антителами [345].
Тест-системы, основанные на амплифицирующем эффекте авидин-биотинового взаимодействия, в настоящее время используются для определения анти-HBs антител [272, 233], антител к М-протеину стрептококка [133, 134].
В качестве универсального детектора в ИФА используется белок А стафилококка, меченный ферментом. Универсальность этого конъюгата объясняется уникальной способностью белка А образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека и различных млекопитающих.
Имеются сообщения об использовании конъюгата белка А стафилококка с ферментом для выявления специфических антител в сыворотках человека, крупного рогатого скота, кролика, свиней, белых мышей и др. [2, 15, 27, 37,41, 64, 69, 171, 267, 268, 281].
Таким образом, по мнению большинства исследователей, ИФА является перспективным методом иммунодиагностики, который достаточно изучен и широко внедряется в лабораторную практику. Объективность количественных оценок в ИФА обеспечивается инструментальным фотометрированием, при этом интенсивность регистрируемых сигналов непосредственно коррелирует с уровнем тестируемых антител. При правильном подборе соответствующего антигена, связываемого с носителем, и подходящего конъюгата, содержащего ферментную метку, можно создать системы тестирования различных антител, основанные на одном и том же наборе манипуляций [36]. Вместе с тем, в использовании любого метода серологической диагностики основная проблема заключается в стандартизации реагентов и системе обработки ре- зультатов. Важно, чтобы серологический анализ и оценка состояния иммунной системы проводились стандартными методами и тест-системами, прошедшими все стадии регистрации. На необходимость проведения исследований по разработке специальных тест-систем для определения титров антител к антигенам определенных групп вакцин, например, вакцин календаря прививок, указывает Н.В. Медуницын [48, 49].
Несомненно, проблема получения тест-систем со стандартизованными свойствами является ключевой в решении задачи производства высококачественных диагностических препаратов, которые должны стать основным инструментом для объективной оценки состояния противоинфекционного и поствакцинального иммунитета.
В заключение следует отметить, что быстрый рост числа важных с точки зрения практического здравоохранения вакцин определяет необходимость осуществления широких по охвату и достаточно простых программ вакцинации, требующих разносторонних исследований в области разработки комбинированных препаратов и создания специальных тест-систем для контроля эффективности иммунизации. В процессе конструирования, оценки и внедрения комбинированных вакцин возникает ряд серьезных проблем, часть из которых мы попытались обсудить в нашем обзоре. Вместе с тем, несмотря на все трудности, встречающиеся в создании комбинированных вакцин, альтернативы использования их в медицинской практике, по-видимому, нет. Число новых комбинированных вакцин, применяемых для профилактики инфекционных болезней быстро увеличивается. Лишь за последние 5 лет мировая вак-цинопрофилактика приобрела около десятка новых комплексных вакцин, состоящих из различных комбинаций АКДС-вакцин, вакцин против гепатита А, В, полиомиелита, гемофильной и менингококковой инфекции. Некоторые из предложенных комплексных вакцин содержат антигены, обеспечивающие развитие иммунитета к 5-6 инфекциям [151, 156, 164, 273]. К сожалению, приходится констатировать, что Россия значительно отстает от ведущих ми- ровых держав в области разработки комбинированных вакцин, особенно со специфической направленностью против гепатита В.
Таким образом, важной практической задачей является разрешение сложившегося дефицита в конструировании комбинированных вакцин и им-муноферментных тест-систем для профилактики и диагностики управляемых инфекций.
На решение этой задачи были направлены исследования, представленные в настоящей работе.
Комбинированные вакцины: история, принципы конструирова ния и проблемы оценки эффективности их применения (обзор данных литературы)
Вакцинопрофилактика, ставшая неотъемлемой отраслью современного здравоохранения, является наиболее экономичным и доступным средством борьбы с инфекционными заболеваниями, а также важным компонентом достижения активного долголетия для всех социальных слоев населения развитых и развивающихся стран [322, 340]. Цели и задачи вакцинопрофилактики определяет Расширенная программа иммунизации (РПИ), принятая ВОЗ в 1974 году. В дальнейшем программа уточнялась и дополнялась, и к настоящему моменту принято выделять три этапа РПИ [80, 306]:
I этап (1974-1990 гг.). Цель РПИ-1 была сформулирована следующим образом: существенное снижение в глобальном масштабе заболеваемости корью, полиомиелитом, дифтерией, коклюшем, туберкулезом и ликвидация натуральной оспы. В качестве средства достижения поставленных целей было рекомендовано вакцинировать не менее 80% детей первого года жизни. В целом задачи РПИ-1 были выполнены, за исключением существенного снижения заболеваемости туберкулезом.
II этап (1991-2000 гг.). РПИ-2 предполагал решение двух глобальных задач: во-первых, усиление контроля за 7 детскими инфекциями — перечень, определенный РПИ-1, дополнен вирусным гепатитом В; во-вторых, планировалось искоренение полиомиелита во всех странах мира, что, однако, не было выполнено.
III этап. Проект РПИ-3 находится сейчас в стадии обсуждения. Но уже очевидно, что он будет нацелен, прежде всего, на расширение числа инфекций, управляемых средствами иммунопрофилактики, и последовательное проведение международных программ по искоренению антропонозов.
От момента гениального опыта Э. Дженнера (1796 г) до ликвидации натуральной оспы на земном шаре (1978 г) прошло 180 лет, за которые разработаны вакцины против очень многих инфекционных заболеваний, часть из которых используется для активной иммунизации в большинстве стран мира [10, 94].
Экспериментальное обоснование включения вакцины гепатита В в состав комбинированных вакцин
Комбинированные вакцины представляют собой препараты, состоящие из двух или более различных иммуногенов физически скомбинированных в одной лекарственной форме. Трудности создания сложной вакцины связаны прежде всего с решением проблем совместимости её компонентов, стабильности и сохранения достаточной иммуногенности препарата [51, 52, 128]. Иммуногенная активность компонентов сложных вакцин может варьировать от многих факторов: биологических свойств используемых в производстве штаммов; качества питательных сред; методов изготовления компонентов; качественных характеристик адъювантов, консервантов, стабилизаторов. Кроме того, химическое или физическое взаимодействие между компонентами вакцины может привести к нарушению иммунного ответа на них [42, 50].
В связи с этим на первом этапе работы было проведено экспериментальное изучение совместимости и конкурентности трех компонентов (дифтерийного, столбнячного и гепатитного) в составе двух вариантов комбинированных вакцин (табл. 5).
Изучение влияния комбинированных вакцин на клеточный и гуморальный ответ у животных
Основной характеристикой иммунного ответа на вакцинные препараты чаще всего становится уровень специфических антител. Действительно, в большинстве случаев сывороточные антитела представляют собой главную линию обороны организма от проникшего патогена. Вместе с тем известно, что в становлении любой антигенспецифической резистентности, наряду с гуморальным, важное значение имеет и клеточный иммунитет [47].
В частности, известна ведущая роль клеточного звена иммунной системы в противовирусной защите, а также в ответе на ряд бактериальных агентов, и, в том числе - на инфекцию, вызываемую В. pertussis [47]. Поэтому оценка специфического клеточного иммунитета представлялась нам весьма важной как в плане характеристики иммунобиологических свойств комбинированных вакцин, так и в отношении возможного использования полученных данных для контроля эффективности проведенной вакцинации.
При изучении влияния вакцин на клеточный иммунный ответ, использовали следующие препараты: моновакцину гепатита В (20 мкг/мл), коклюшную суспензию (взвесь инактивированных В. pertussis, 20 млрд/мл), адсорбированный столбнячный анатоксин, адсорбированный дифтерийный анатоксин; а также коммерческие препараты: АДС-М-анатоксин, вакцины АКДС, Бубо-М и Бубо-Кок. В качестве контроля вводили гель гидроксида алюминия - адсорбента, входящего в состав всех перечисленных препаратов за исключением коклюшной суспензии. Концентрация геля гидроксида алюминия в 0,9 %-ном растворе натрия хлорида составляла 60 мкг/мл, что соответствует максимальному содержанию этого вещества во взятых для исследования препаратах.
Для оценки влияния вакцин на клеточное звено иммунной системы сравнивали такие их характеристики, как влияние на массу и клеточность регионарных лимфатических узлов и способность вызывать реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Опыты выполнялись на нелинейных мышах-самцах массой 16-20 г. Исследуемые препараты в объеме 0,03 мл вводили в подошвенную поверхность правой задней лапки, при этом в контрлатеральную конечность животные получали равный объем изотонического раствора натрия хлорида. Через 7 суток проводили разрешающую инъекцию монопрепаратов в том же объеме (соответственно, в контрольную конечность вводили 0,03 мл изотонического раствора натрия хлорида).
Разработка технологии получения антивидового конъюгата F(ab')2-фрагментов антител сыворотки лошади против IgG человека аффинноочищен-ных, меченых пероксидазой хрена
В Пермском НИИ вакцин и сывороток накоплен большой опыт получения аффинноочищенных антител (столбнячных, дифтерийных, ботулиниче-ских, стафилококковых, гангренозных) из сывороток крови гипериммунизиро-ванных лошадей [22, 23, 65, 76, 86]. На этой основе и с учетом доступности исходного материала были предприняты исследования по созданию промышленного метода получения конъюгата на основе F(ab )2 -фрагментов аффинно-очищенных антител лошади к IgG человека и пероксидазы хрена и испытание его в качестве индикатора антител.
Иммунизация лошадей IgG человека
В качестве исходного материала для извлечения антител были использованы гипериммунные сыворотки лошади. В этой связи первый этап работы состоял в выборе оптимальной схемы иммунизации лошадей. Были взяты три лошади в возрасте от 3 до 7 лет и весом 400-450 кг, удовлетворяющие по физическим свойствам требованиям иммунизации. В качестве антигена использовали «Иммуноглобулин человека нормальный» (коммерческий препарат, выпускаемый НПО «Биомед»), дозированный по содержанию белка.
Две лошади (№№ 933 и 217) были предварительно грундированы 30-40 мг иммуноглобулина в неполном адъюванте Фрейнда. Цикловую иммунизацию начинали через 40-45 дней после грундирования, применяя антиген, преципи-тированный алюмокалиевыми квасцами, содержание которых в смеси с антигеном составляло 1 %. Антиген вводили внутримышечно в область спины в повышающихся дозах (30-60-90-120-150 мг белка на инъекцию). Иммунизацию проводили циклами по 3-5 инъекций с интервалом между ними в 4-7 дней.
Третья лошадь № 6 иммунизировалась по другой схеме. Грундирование проводили внутримышечно одномоментно 100 мг иммуноглобулина в полном адъюванте Фрейнда. Через 6 и 10 недель вводили по 30 мг иммуноглобулина в неполном адъюванте Фрейнда. Через 7-8 дней после последней инъекции у лошадей брали пробы сыворотки крови. Для контроля антителообразования в динамике иммунизации использовали реакцию пассивной гемагглютинации с формалинизированными и таннизированными эритроцитами, которые были сенсибилизированы иммуноглобулином G человека. Для окончательной оценки пригодности иммунных сывороток к дальнейшему выделению антител применяли реакцию диффузионной преципитации в агаровом геле, используя в качестве антигена иммуноглобулин G человека в концентрации 1 мг/мл (выделение иммуноглобулина G из сыворотки крови человека см. ниже).
У двух лошадей, иммунизированных по первой схеме, после 4-5 цикла иммунизации титр преципитинов составлял 1:16 - 1:32. После кровопускания (по 5 л крови) лошадям был дан отдых с ежемесячным контролем титров антител в сыворотках крови. При значительном снижении титров продолжали иммунизацию по той же схеме.
У лошади № 6, которую иммунизировали по второй схеме, антитела регистрировались в низких тшрах. После первых циклов иммунизации титр антител не превышал 1:4. В дальнейшем эта лошадь была переведена под иммунизацию по первой схеме, и после 3 цикла у неё был зарегистрирован титр антител 1:32. Таким образом, последующая иммунизация трех лошадей продолжена по единой схеме. Годными для дальнейшей работы считали сыворотки с титром не менее 1:16 по диффузионной преципитации. Полученные сыворотки служили исходным материалом для выделения с помощью аффинной очистки F(ab )2 -фрагментов антител против IgG человека.
Следует отметить, что использование для получения гипериммунной сыворотки таких продуцентов как лошади позволило иметь в достаточном количестве материал для отработки и стандартизации параметров технологического процесса фрагментации иммуноглобулинов и последующего выделения F(ab )2 -фрагментов высокой степени очистки.
Использование ИФТС (непрямой вариант) для определения уровня дифтерийного и столбнячного антитоксинов в человеческих сыворотках
Защиту от дифтерии и столбняка обеспечивает гуморальный антитоксический иммунитет [315]. В плане эпидемиологического надзора за этими инфекциями очень важным моментом является определение уровня коллективного иммунитета, обеспечивающего стабильность эпидситуации. Для определения антитоксинов применяют различные методы: реакция нейтрализации токсина на животных (РН) [78], реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) [33, 38, 270, 276], различные варианты иммуноферментного анализа (ИФА) [176, 188, 189, 190, 214, 223, 224, 244, 253, 254], реакция нейтрализации в культуре клеток [105, 185, 211]. В практическом здравоохранении России для определения антитоксинов (дифтерийного и столбнячного) широко применяется РПГА, которая наряду с преимуществами (простота постановки, быстрое получение результатов, отсутствие потребности в специальной аппаратуре) имеет и некоторые недостатки, из которых основной - невозможность получения точного количественного результата, так как учет проводится визуально и поэтому достаточно субъективен. Вместе с тем, до сих пор дискутируется вопрос, какой титр антител в РПГА соответствует защитному уровню дифтерийного и столбнячного антитоксинов. Согласно рекомендации ВОЗ, циркулирующие противодифтерийные антитела в титре 0,03 МЕ/мл и противостолбнячные 0,01 МЕ/мл, определенные в РН на животных, обеспечивают защиту от инфекции. Сравнительная оценка ИФА с РПГА, РН in vivo, РН в культуре клеток и другими методами определения антитоксинов широко отражена в работах отечественных и зарубежных авторов [105, 303, 304, 324, 329]. При этом следует отметить, что данные весьма противоречивы.
Так ряд авторов [105, 303, 304, 329] указывает на достаточно высокую степень корреляции результатов ИФА и РН (г = 0,81-0,95), другие утверждают, что при исследовании сывороток с низкими титрами антитоксинов имеются существенные расхождения между результатами ИФА и тестами нейтрализации [44, 46, 140].
Целью настоящего раздела работы было сопоставление результатов определения уровня антитоксинов (дифтерийного и столбнячного) при использовании разработанных тест-систем, РПГА и РН на животных.
Материалом исследования служили образцы сывороток людей с различным содержанием дифтерийных и столбнячных антител. Результаты параллельного исследования этих образцов в РН, РПГА и ИФА приведены на рис. 27-28.
Как видно из полученных данных между РПГА и РН, РПГА и ИФА во всех сравниваемых группах наблюдалась явно недостаточная степень совпадения результатов: коэффициент корреляции составлял 0,50-0,78. Аналогичные результаты при сравнении РПГА и РН были отмечены в работах S. Walory et al [329], Г.Я. Ценевой с соавт. [105].
В то же время при оценке противодифтерийного и противостолбнячного иммунитета у людей в ИФА и РН получены практически одинаковые результаты: г 0,9. Согласно требованиям ВОЗ, замена одного метода на другой возможна при условии, если коэффициент корреляции результатов при использовании сравниваемых методов не менее 0,9. Следовательно, непрямой вариант с применением разработанных нами тест-систем вполне может заменить биопробу - классический метод определения антитоксинов.
