Содержание к диссертации
Список сокращений 4
Введение 7
Актуальность проблемы 7
Цель работы 8
Задачи работы 8
Научная новизна 8
Научно-практическая ценность работы 9
Основные положения, выносимые на защиту 9
Апробация работы 10
Объем и структура работы 10
Обзор литературы 11
Глава 1 Введение 11
Глава 2 Классификация герпесвирусов 12
Глава 3 Структурные особенности герпесвирусов 14
Глава 3.1 Вирус простого герпеса 1-2 16
Глава 3.2 Вирус Эпштейна-Барр 18
Глава 3.3 Цитомегаловирус 23
Глава 3.4 Вирус герпеса человека 6 типа 23
Глава 4 Патогенез герпесвирусных инфекций 24
Глава 4.1 Иммунный ответ хозяина на присутствие вируса 24
Глава 4.2 Инфекция на уровне клетки (репликация вируса) 30
Глава 4.3 Инфекция на уровне организма (вирусная инфекция) 34
Глава 4.3.1 Иммуиокомпетентные идивиды 34
Глава 4.3.2 Гематологические больные 40
Глава 5 Клинические проявления герпесвирусных инфекций 42
Глава 5.1 Вирус простого герпеса 1 и 2 типов 42
Глава 5.2 Варш/елла-'Зостер вирус 43
Глава 5.3 Цитомегаловирус 46
Глава 5.4 Вирус Эпштейна-Барр 48
Глава 5.5 Вирус герпеса человека 6 типа 52
Глава 6 Герпесвирусные инфекции у лиц со сниженным иммунитетом 54
Глава 6.1 ВИЧ-инфицированные 54
Глава 6.2 Лица пожилого возраста 58
Глава 6.3 Гематологические больные 59
Глава 7 Лабораторная диагностика герпесвирусов 62
Глава 7.1 Вирусологический метод (культивирование вирусов) 64
Глава 7.2 Морфологический, цитологический, гистологический методы 65
Глава 7.3 Иммунохимический метод 66
Глава 7.4 Серологические методы 67
Глава 7.5 Молекулярные методы 76
Глава 7.5.1 Гибридизация in situ 76
Глава 7.5.2 Полимеразная цепная реакция 76
Глава 7.5.3 NASBA 79
Глава 7.6 Федеральная система внешней оценки качества клинических лабораторных исследований... 80
Собственные исследования 82
Глава 1 Материалы и методы исследования 82
Глава 1.1 Биологические атериалы 82
Глава 1.2 Больные и доноры, включенные в исследование 83
Глава 1.2.1 Больные острыми лейкозами. Проспективное исследование 83
Глава 1.2.2 Больные, находящиеся на стационарном лечении в ГНЦ РАМН. 84
Глава 1.2.3. Доноры компонентов крови. 85
Глава 1.2.4 Доноры стволовых гемопоэтических клеток 85
Глава 1.3 Методы 85
Глава 1.3.1 Иммуноферментный анализ 85
Глава 1.3.2. Иммуноблот 88
Глава 1.3.3 Иммунохимический анализ 88
Глава 1.3.4 Полимеразная цепная реакция 89
Выделение ДНК: 89
Амплификация 90
Участки амплификации и длина специфических полос амплифицированных фрагментов: 91
Электрофорез 91
Глава 1.4. Интерпретация комбинации маркеров 92
Глава 1.5. Статистическая обработка данных 93
Глава 2 Результаты и их обсуждение 93
Глава 2.1 Результаты 93
Глава 2.1.1 Маркеры герпесвирусов в гематологическом стационаре (ретроспективное исследование)
Глава 2.1.2 Маркеры герпесвирусов у больных острыми лейкозами (проспективное исследование) 101
Серологические маркеры у больных ОЛ 705
Результаты Вестерн-блота 106
Иммунологические исследования сывороток больных ОЛ 108
Мониторинг серологических и молекулярных маркеров активных ГВИу больных ОЛ 110
Маркеры ВГЧ 6 у больных ОЛ. 114
Связь маркеров активных ГВИ с инфекционными осложнениями у больных ОЛ в ходе индукционной
терапии 115
Глава 2.1.3 Маркеры герпесвирусов у доноров компонентов крови и стволовых гемопоэтических клеток
: 116
Глава 2.1.3.1 Доноры крови 117
Глава 2.1.3.2 Доноры стволовых гемопоэтических клеток 118
Глава 2.2 Обсуждение 119
Выводы 130
Благодарности 131
Литература 132
Список сокращений
7+3+VP16 - курс полихиомитерапии, включающий цитозар, рубомицин и
вепезид CD - кластер дифференцировки DPBS - фосфатно-солевой буфер EBNA - ядерный антиген вируса Эпштейна-Барр HLA - human lymphocitic antigen ICP -infected cell protein IgG - иммуноглобулины класса G IgM - иммуноглобулины класса M IRF - interferon regulatory factor
LMP - латентный мембранный протеин вируса Эпштейна-Барр МНС - главный комплекс гистосовместимости NASBA - nucleic acid single binding amplification NAT - nucleic acid technology STAT - signal transducers activation transcription Th - Т-хелперы Ts - Т-супрессоры
VCA - вирусный капсидный антиген вируса Эпштейна-Барр VHS - virus host-shut off protein АГ - антиген AT — антитело АТФ - аденозинтрифосфат БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж ВГЧ 6, 7, 8 - герпесвирус человека 6, 7 и 8 типа
ВЗВ - варицелла-зостер вирус
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
ВКО - внутренний контрольный образец.
ВПГ - вирус простого герпеса
ВЭБ - вирус Эпштейна-Барр
ГВ - герпесвирусы
ГВИ - герпесвирусные инфекции
ГМ-КСФ - колониестимулирующий фактор гранулоцтов и макрофагов
ГНЦ РАМН - Гематологический Научный Центр Российской Академии
Медицинских Наук ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДЭПК — диэтилпирокарбонат ЕА - ранний антиген вируса Эпштейна-Барр ЕД - единица ИЛ - интерлейкин ИФА - иммуноферментный анализ ИФН - интерферон
КДЛ - клиническая лабораторная диагностика МПК (РВМС) - мононуклеары периферической крови мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота МФ - макрофаги НК - натуральные киллеры
ННФК - недифференцированная назофарингеональной карцинома ОЛ - острый лейкоз ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз ОМЛ - острый миелобластный лейкоз
п.н. - пар нуклеотидов
ПХТ - полихимиотерапия
ПЦР (PCR) - полимеразная цепная реакция
РАЛ — реакция агглютинации латекса
РИФ - реакция иммунофлуоресценции
РН - реакция биологической нейтрализации вируса
РНК - рибонуклеиновая кислота
РПГА — реакция пассивной гем агглютинации
РСК - реакция связывания комплемента
РТПХ - реакция «трансплантат против хозяина»
СГК — стволовые гемопоэтические клетки
СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита
ТКМ — трансплантация костного мозга
ТСГК - трансплантация стволовых гемопоэтических клеток
у.е. - условных единиц
ФГУН ЦНИИЭ - Федеральное государственное учреждение центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии ФНО - фактор некроза опухоли ФСВОК - федеральная система внешней оценки качества лабораторных
исследований ЦМВ — цитомегаловирус ЦНС — центральная нервная система ЦТЛ — цитотоксические лимфоциты ЭДТА - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Повсеместная распространенность герпесвирусов (ТВ) в природе, разнообразие путей и способов их передачи, способность к пожизненной персистенции в организме хозяина и пантропность приводят к практически тотальной инфицированности взрослого населения этими вирусами [1, 2, 5, 6]. У больных с иммунодефицитом, к которым относятся ВИЧ-инфицированные в стадии СПИДа, больные после трансплантации солидных органов, а так же гематологические больные, герпетические инфекции, как правило, характеризуется более тяжелым течением, и могут угрожать жизни больного при отсутствии своевременной диагностики и терапии [1, 2, 5, 9, 10,75,91,92]. На первых этапах химиотерапии гематологического заболевания и при трансплантации аллогенного костного мозга, когда индуцируется глубокая иммуносупрессия и увеличивается вероятность развития герпетической инфекции, особенно важна своевременная и адекватная лабораторная диагностика этих инфекций [6,7 9,14,19,80].
В клинической практике часто возникают сложности в трактовке результатов лабораторных исследований, зачастую довольно противоречивых, что затрудняет установление этиологии инфекционного осложнения [9,10,14,42,91,92]. ГВИ может протекать в виде мононуклеозоподобного синдрома, тромбоцитопении, нейтропении, гепатита, энтерита, пневмонии.
Инфекции, вызванные разными вирусами герпетической группы, могут иметь одинаковые симптомы, что обусловливает необходимость дифференциальной диагностики.
ЦМВ-инфекция является частым осложнением у больных после трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток. Этой проблеме посвящены многочисленные исследования. Однако и здесь имеется много противоречивых данных, требующих дальнейшего изучения. Практически не
отражена в литературе проблема развития ГВИ у больных гемобластозами, в том числе у больных острыми лейкозами. Не определены факторы риска развития этих осложнений у данной категории больных. Не разработаны принципы профилактики этих инфекций на фоне цитостатической химиотерапии. Не определена значимость и необходимость проведения мониторинга маркеров ГВИ у этих больных. В то же время каждый раз при выявлении того или иного маркера ГВИ встает вопрос о необходимости проведения противовирусной терапии токсичными препаратами. Все это послужило поводом к проведению собственного исследования по мониторингу ГВИ у различных групп гематологических больных.
Цель работы.
Определить частоту лабораторного выявления герпесвирусных инфекций у больных гематологического стационара
Задачи работы
Выявить наиболее значимые герпесвирусы у гематологических больных, ассоциированные с инфекционными осложнениями, возникающими в ходе химиотерапии основного заболевания
Оценить информативность методов ИФА и ПЦР в диагностике герпесвирусов у гематологических больных
Провести динамическое обследование больных острыми лейкозами на маркеры активных герпесвирусных инфекций в ходе первого курса химиотерапии
Сравнить спектр герпесвирусных инфекций у гематологических больных и доноров крови и костного мозга
Научная новизна
Определена доля активных ГВИ в структуре инфекционных осложнений у больных гематологического стационара. Выявлен наиболее часто встречающийся герпесвирус у гематологических больных.
Установлена частота и динамика выявления активных герпесвирусных инфекций у больных острыми лейкозами.
Определена специфичность выявления различных маркеров активных
герпесвирусных инфекций у больных острыми лейкозами и
охарактеризована их связь с инфекционными осложнениями.
Научно-практическая ценность работы
Определены объем и сроки проведения вирусологического обследования больных острыми лейкозами, позволяющие снизить вероятность развития ГВИ в процессе индукции ремиссии.
Установлена связь между наличием маркеров активных герпесвирусных инфекций и инфекционными осложнениями у гематологических больных
Определена частота выявления маркеров герпесвирусов у доноров крови и стволовых гемопоэтических клеток.
Основные положения, выносимые на защиту
У гематологических больных, при развитии инфекционных осложнений, достоверно чаще определяются лабораторные признаки активации ВЭБ, реже ЦМВ и ВПГ 1-2.
При развитии пневмонии у гематологических больных, в БАЛ достоверно чаще определяется ДНК ВЭБ, реже ВПГ 1-2 и ЦМВ. При этом исследование БАЛ более информативно, чем исследование крови.
Метод ИФА и ПЦР в диагностике герпесвирусов взаимно дополняют друг друга.
У больных в дебюте острого лейкоза, выявляются лабораторные признаки активации ВЭБ и ВПГ 1-2 достоверно чаще, чем у доноров крови. Однако перед вторым курсом химиотерапии частота выявления маркеров активных герпесвирусов становится статистически неотличима от таковой у доноров.
Выявление маркеров активных герпесвирусных инфекций у больных острыми лейкозами, как правило, было ассоциировано с проявлениями
инфекционных осложнений как в дебюте заболевания, так и в ходе первого курса химиотерапии.
Апробация работы
Результаты работы представлены на XIV, XV, XVI и XVII международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье» (С.Петербург 2005, 2006, 2007, 2008), на Юбилейной конференции, посвященной 75-летию Республиканскому Научно-практическому Центру Гематологии и Трансфузиологии МЗ р. Беларусь в рамках VI Съезда гематологов и трансфузиологов р. Беларусь «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии» (р. Беларусь 2007), На заседании отдела молекулярной вирусологии НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского (г.Москва 2007)
Объем и структура работы
Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Объем диссертационной работы составляет 142 страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 17 таблицами, 21 рисунками. Список литературы составляет 119 наименований, 25 из которых отечественных, 94 зарубежных
Обзор литературы
