Содержание к диссертации
Список основных сокращений 4
Введение 6
Глава 1. Иммунодиагностика инфекций, управляемых средствами специфической иммунопрофилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В): 11
Серологические исследования в системе эпидемиологического надзора за коклюшем 14
Значение серологических исследований при НВ-вирусной инфекции 18
Серологический мониторинг за дифтерией и столбняком 22
Иммуноферментный анализ - как один из методов иммунодиагностики 24 Глава 2. Материалы и методы 32 Глава 3. Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для диагностики управляемых инфекций (дифтерия, столбняк, коклюш и гепатит В): 42
Получение биотинилированного белка А 42
Получение биотинилированного HBsAg 47
3.3. Конструирование иммуноферментных тест-систем с ис
пользованием универсального конъюгата 49
Глава 4. Валидация разработанных иммуноферментных тест-систем 56
Линейность и параллелизм 56
Точность 61
Сравнительная оценка определения уровня антител в сыворотках крови человека и животных с использованием разработанных иммуноферментных тест-систем и регламентированных методов 62
Специфичность 67
Диагностическая чувствительность и специфичность 69
з
Глава 5. Применение разработанных иммуноферментных тест-систем
для количественного определения уровня антител в сыворотках кро
ви человека и животных 72
Заключение 97
Выводы 104
Список литературы 105
Приложение 146
Список основных сокращений
HBsAg поверхностный антиген вируса гепатита В
АДС-М анатоксин дифтерийно-столбнячный адсорбированный
с уменьшенным содержанием антигенов
АКДС вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная
адсорбированная
АаКДС вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорби-
рованная с ацеллюлярным коклюшным компонентом
СГТ средняя геометрическая титра
ТБР трис-HCl буферный раствор (рН 7,4)
ТМБ 3,3',5,5'-тетраметилбензидин
ФСБ фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,2-7,4)
Введение к работе
Вакцинопрофилактика рассматривается в настоящее время не только как эффективное, наиболее доступное и экономичное средство в борьбе с инфекциями, но и как средство достижения активного долголетия во всех социальных группах населения развитых и развивающихся стран [14, 16, 17, 39, 112].
Цели и задачи массовой иммунизации в национальных масштабах и в масштабе планеты определяет в настоящее время расширенная программа иммунизации (РПИ), которую сформулировала в 1974 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ). В реализации данной программы участвуют 169 стран мирового сообщества.
В рамках РПИ предусмотрен контроль целого ряда инфекционных болезней с помощью средств специфической профилактики [80, 141, 161, 163].
В системе эпидемиологического надзора за этими инфекциями (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В) важной составной частью является серологический мониторинг. Этой точки зрения придерживаются и эксперты Консультативной группы ВОЗ по проблемам РПИ, которые более 15 лет назад при подготовке рекомендаций и инструкций по целевым национальным программам иммунизации для Европейских стран включили использование в системе эпидемиологического надзора выборочного серологического мониторинга [143].
В соответствии с рекомендациями ВОЗ ряд стран (Финляндия, Швеция, Дания, Польша, Австралия, Япония и др.) включили серологический мониторинг в систему эпидемиологического надзора за инфекциями, управляемыми средствами специфической профилактики [138].
Сыворотка крови служит источником комплексной информации о наличии в ней спектра антител к возбудителям болезней. Способы определения специфических антител могут быть различными. Так, реакция нейтрализации токсина является весьма чувствительным методом и остается «золотым стандартом» при определении дифтерийных и столбнячных антитоксинов. Одна-
ко, данный метод весьма дорог, длителен, сложен и требует наличия квалифицированного персонала.
Для определения специфических антител используются также реакции пассивной гемагглютинации и агглютинации, которые также имеют некоторые недостатки, в частности, невозможность получения точного количественного результата, так как учет проводится визуально и поэтому достаточно субъективен [107].
В настоящее время интенсивно разрабатываются методы иммунофер-ментного анализа, которые по сравнению с другими способами детекции антител обладает следующими преимуществами:
высокой чувствительностью, которая определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;
возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;
экспрессностыо;
полной безопасностью определений;
стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА;
простотой проведения реакции;
наличием как визуального, так и инструментального учета.
Высокая производительность метода, возможность унификации и стандартизации диагностических тест-систем, а также автоматизация учета результатов делают ИФА предпочтительным при проведении массовых серологических исследований.
В отечественных иммуноферментных тест-системах и большинстве зарубежных, рассчитанных на определение антител различной специфичности в сыворотках крови человека, а опосредованно и антигенов, применяют конъюгаты антивидовых антител (против иммуноглобулина G человека) с ферментами-маркерами. Однако способ получения антивидовых антител,
включающий использование животных, достаточно трудоемок и длителен по времени.
Перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидин-биотин [107, 221, 233, 240]. Исследователи отмечают, что при использовании этих конъюгатов достигается чрезвычайно высокая чувствительность и специфичность определения, а также в значительной степени снижаются фоновые реакции [107, 275].
В качестве универсального детектора в ИФА используется белок А стафилококка, меченный ферментом. Универсальность этого конъюгата объясняется уникальной способностью белка А образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека и различных млекопитающих [1,2].
В этой связи актуальны исследования по получению конъюгатов (простых в исполнении и доступных по цене) и создания на их основе иммуно-ферментных тест-систем, пригодных для массовых серологических исследований.
Цель исследования - экспериментально обосновать и сконструировать твердофазные иммуноферментные тест-системы для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) на основе ампли-фицирующего комплекса авидин-биотин.
Задачи исследования
Разработать эффективный и технологичный способ приготовления конъюгата.
Сконструировать оптимальные композиции иммуноферментных тест-систем на основе амплифицирующего авидин-биотинового комплекса.
Оценить качество разработанных тест-систем по следующим критериям: линейность и параллелизм, чувствительность, специфичность, точность, сравнение с референс-методами.
Определить область применения разработанных иммуноферментных тест-систем.
Научная новизна
Впервые предложен универсальный антиглобулиновый маркер на основе белка А золотистого стафилококка, меченного биотином. Показана возможность эффективного применения сконструированного конъюгата для определения антител различной специфичности (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) в сыворотках крови человека и животных.
Экспериментально обоснована и разработана оригинальная конструкция иммуноферментной тест-системы для выявления анти-HBs с использованием биотинилироваиного конъюгата на основе рекомбинантного HBsAg (патент № 2206095 от 10.06.03 г.).
Впервые разработана оригинальная конструкция иммуноферментной тест-системы для определения коклюшных антител на основе биотинилироваиного белка А (приоритетная справка № 2006127549 от 31.07.2006 г.).
Практическая значимость работы
Разработана технология приготовления универсальных конъюгатов на основе биотинилированных белка А и рекомбинантного HBsAg, не требующая больших экономических затрат.
Разработана и утверждена нормативно-техническая документация на производство тест-системы иммуноферментной для выявления антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (Фармакопейная статья № 42-0504656005, Производственный регламент № 04862997-79-06). Получено регистрационное удостоверение (ЛС-000884 от 03.11.2005 г.) и лицензия на производство (99-04-000097 от 27.10.2005 г.).
Использование разработанных тест-систем обеспечивает эффективный серологический мониторинг за инфекциями, управляемыми средствами иммунопрофилактики, на основе количественной оценки уровня специфических антител.
Изданы и внедрены в работу территориальных отделов Управления Роспотребнадзора по Пермскому краю и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае» методические рекомендации «Эпидемиологический надзор и контроль за коклюшной инфекцией».
Положения, выносимые на защиту
Получены универсальные конъюгаты и сконструированы на их основе иммуноферментные тест-системы для индикации специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs).
Разработанные тест-системы соответствуют критериям, предъявляемым ВОЗ к наборам для иммунологических испытаний (линейность и параллелизм, чувствительность, специфичность, точность, сравнение с референс-методами).
Определена область применения разработанных иммуноферментиых тест-систем.
![Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) [Электронный ресурс]](/i/i/4438/210884.png "Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) [Электронный ресурс] Вязникова Татьяна Владимировна")
