Введение к работе
Актуальность темы. Важнейшими условиями увеличения производства животноводческой продукции являются максимальное сохранение новорожденного молодняка и снижение заболеваемости животных путем освоения производством новейших достижений науки и передовой практики. Многочисленные литературные данные показывают, что наиболее сложный период сохранения молодняка — это первые 10-15 дней после рождения, когда он наиболее подвержен болезням желудочно-кишечного тракта — эшерихиоз, ротавирусный и коронавирусный энтериты и.т.д. На этот период приходится около 50% потерь молодняка сельскохозяйственных животных. Именно в это время животным присуща желудочнокишечная патология; риск заболеть достигает 100%, что связано с рядом физиологических особенностей их организма. Отмечено, что в становлении нормобиоза кишечной микрофлоры в постнатальном онтогенезе имеется закономерность: в первые четверо суток интенсивно заселяется в кишечнике грамотрицательная микрофлора, в которой преобладают токси-генные эшерихии, патогенные для новорожденных, страдающих гипогаммаглобулинемией.
Возбудителями эшерихиоза являются разновидности эшерихии, имеющие факторы патогенности; энтеротоксины термолабильный и термостабильный, эндотоксин, веротоксин, адгезивные антигены и.т.д. При этом основную роль в развитии эшерихиоза играют фимбриальные адгезины, обеспечивающие бактериям возможность прикрепляться к эпителию кишечника и колонизировать его, и энтеротоксины, стимулирующие развитие диареи.
Адгезивные антигены представляют собой выросты нитевидной формы, радиально отходящие от клеточной стенки. Известны адгезины К88 (К88 ав, К88 ас, К88 ad), К99, 987Р, F41 и.т.д. Установлено, что штаммы с адгезивными антигенами обычно продуцируют и энтеротоксин, и обладают высокой иммуногенностью. Распространенность антигенов адгезии изучают в ветеринарных лабораториях стран СНГ только с 1988 года, когда было налажено производство антиадгезивных колисывороток. При этом большинство из методов исследований основано на применении по-ликлональных антисывороток, что достаточно снижает качество проводимых исследований, обусловленное гетерогенностью антител. Необходимо также учитывать трудоемкость получения
моноспецифических сывороток, причем нельзя гарантировать идентичность качества сывороток различных партий. Альтернативой антисывороткам явились моноклональные антитела (МКА), получение которых обеспечило создание мощного и тонкого инструмента исследований практически во всех областях биологии. Основным достоинством моноклональных антител является возможность их получения в неограниченном количестве с идентичными от партии к партии физикохимическими характеристиками, что позволяет создавать на их основе стандартные диагностические реагенты.
Целью настоящей работы является получение штаммов гибридных культивируемых клеток (гибридом), продуцирующих моноклональные антитела к адгезивному антигену К88 эшерихий, и разработка на их основе экспресс-метода диагностики эше-рихиоза.
Для достижения поставленной цели перед нами были поставлены следующие задачи:
1. Отработать методы получения и очистки адгезивного антигена Е.соП.
-
Получить штаммы гибридных клеток, продуцирующие моноклональные антитела к адгезивному антигену К88 E.coli.
-
Изучить основные характеристики полученных моноклональных антител.
-
Отработать условия и технику постановки сэндвич-варианта иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител для обнаружения адгезивного антигена К88 E.coli в биологическом материале животных.
Научная новизна. Впервые получены штаммы гибридных культивируемых клеток — продуцентов моноклональных антител к адгезивному антигену К88 эшерихий. Штаммы гибридных клеток ФАП и C10F6 депонированы (регистрационные номера 01/Г и 6-94) в коллекции культур клеток Научно-исследовательского сельскохозяйственного института Национального центра по биотехнологии Республики Казахстан. На штамм гибридомы C10F6 — продуцента моноклональных антител к адгезивному антигену эшерихий — получен предварительный патент Национального патентного ведомства Республики Казахстан за № 940331.1. от 16.03.94. г. Отработаны методы постановки различных вариантов иммуноферментного анализа на основе использования моноклональных антител, позволяющие иденти-
фицировать адгезивные антигены эшерихий в биологическом материале за 3-3,5 часа.
Практическая значимость. Получены моноклональные антитела, которые могут быть использованы для дифференциации К88 адгизинпозитивных штаммов эшерихий от других перекрестно реагирующих микроорганизмов, а так же в качестве высокоспецифических иммунореагентов при разработке эффективных диагностикумов. Сэндвич-вариант иммуноферментного анализа на основе полученных моноклональных антител может быть использован для экспресс - обнаружения адгезивного антигена К88 эшерихий.
Внедрение. Материалы диссертационной работы используются в лабораториях инфекционных заболеваний животных биотехнологического центра, отделе бактериологии Республиканской ветеринарной лаборатории и на кафедре заразных болезней факультета ветеринарной медицины Акмолинского аграрного университета им. С. Сейфуллина.
Апробация. Основные результаты работы доложены на Республиканской научно-практической конференции "Резервы биотехнологии, ветеринарной медицины и зоотехнии в повышении эффективности животноводства", г. Алматы, 1995; Международной научно-практической конференции " Аграрная наука на рубеже веков", г. Акмола, 1997; на конференции "Актуальные проблемы сельскохозяйственной биотехнологии", посвященной 40-летию научно-исследовательского сельскохозяйственного института Национального центра по биотехнологии Республики Казахстан, п.г.т. Гвардейский, 1998; итоговой научно-практической конференции медицинской академии г. Астаны, 1998 год; Международной научно-практической конференции, посвященной 120-летию К.И. Скрябина, г. Астана, 1998 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Штаммы гибридных культивируемых клеток ФАП, 4Н4, 4F4 — продуценты моноклональных антител к эпитопу адгезивного антигена К88 E.coli (белку с мол. массой 25 КДа).
-
Сэндвич-вариант иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител как экспресс метод обнаружения адгезивного антигена К88 ( за 3 -3,5 часа ). Чувствительность теста - 3-6 нг/мл антигена К88 , 250-300 тыс. микроб, кл/мл.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на
страницах и состоит из введения, обзора литературы, ма
териалов и методов исследований, 3 глав исследований, заклю
чения, выводов, практических предложений, списка использо
ванной литературы и приложения. Список использованных
источников литературы включает 180 наименований работ. Ма
териалы иллюстрированы 13 таблицами, 3 фотографиями, 3
графиками, 1 диаграммой.
![Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) [Электронный ресурс]](/i/i/4438/210884.png "Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) [Электронный ресурс] Вязникова Татьяна Владимировна")
