Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) [Электронный ресурс] Вязникова Татьяна Владимировна

Содержание к диссертации

Список основных сокращений 4

Введение 6

Глава 1. Иммунодиагностика инфекций, управляемых средствами специфической иммунопрофилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В): 11

1. Серологические исследования в системе эпидемиологического надзора за коклюшем 14

2. Значение серологических исследований при НВ-вирусной инфекции 18

3. Серологический мониторинг за дифтерией и столбняком 22

4. Иммуноферментный анализ - как один из методов иммунодиагностики 24 Глава 2. Материалы и методы 32 Глава 3. Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для диагностики управляемых инфекций (дифтерия, столбняк, коклюш и гепатит В): 42

5. Получение биотинилированного белка А 42

6. Получение биотинилированного HBsAg 47

3.3. Конструирование иммуноферментных тест-систем с ис
пользованием универсального конъюгата 49
Глава 4. Валидация разработанных иммуноферментных тест-систем 56

7. Линейность и параллелизм 56

8. Точность 61

9. Сравнительная оценка определения уровня антител в сыворотках крови человека и животных с использованием разработанных иммуноферментных тест-систем и регламентированных методов 62

10. Специфичность 67

11. Диагностическая чувствительность и специфичность 69

з
Глава 5. Применение разработанных иммуноферментных тест-систем
для количественного определения уровня антител в сыворотках кро
ви человека и животных 72
Заключение 97
Выводы 104
Список литературы 105
Приложение 146

Список основных сокращений

HBsAg поверхностный антиген вируса гепатита В

АДС-М анатоксин дифтерийно-столбнячный адсорбированный

с уменьшенным содержанием антигенов

АКДС вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная

адсорбированная

АаКДС вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорби-

рованная с ацеллюлярным коклюшным компонентом

СГТ средняя геометрическая титра

ТБР трис-HCl буферный раствор (рН 7,4)

ТМБ 3,3',5,5'-тетраметилбензидин

ФСБ фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,2-7,4)

Введение к работе

Вакцинопрофилактика рассматривается в настоящее время не только как эффективное, наиболее доступное и экономичное средство в борьбе с инфекциями, но и как средство достижения активного долголетия во всех социальных группах населения развитых и развивающихся стран [14, 16, 17, 39, 112].

Цели и задачи массовой иммунизации в национальных масштабах и в масштабе планеты определяет в настоящее время расширенная программа иммунизации (РПИ), которую сформулировала в 1974 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ). В реализации данной программы участвуют 169 стран мирового сообщества.

В рамках РПИ предусмотрен контроль целого ряда инфекционных болезней с помощью средств специфической профилактики [80, 141, 161, 163].

В системе эпидемиологического надзора за этими инфекциями (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В) важной составной частью является серологический мониторинг. Этой точки зрения придерживаются и эксперты Консультативной группы ВОЗ по проблемам РПИ, которые более 15 лет назад при подготовке рекомендаций и инструкций по целевым национальным программам иммунизации для Европейских стран включили использование в системе эпидемиологического надзора выборочного серологического мониторинга [143].

В соответствии с рекомендациями ВОЗ ряд стран (Финляндия, Швеция, Дания, Польша, Австралия, Япония и др.) включили серологический мониторинг в систему эпидемиологического надзора за инфекциями, управляемыми средствами специфической профилактики [138].

Сыворотка крови служит источником комплексной информации о наличии в ней спектра антител к возбудителям болезней. Способы определения специфических антител могут быть различными. Так, реакция нейтрализации токсина является весьма чувствительным методом и остается «золотым стандартом» при определении дифтерийных и столбнячных антитоксинов. Одна-

ко, данный метод весьма дорог, длителен, сложен и требует наличия квалифицированного персонала.

Для определения специфических антител используются также реакции пассивной гемагглютинации и агглютинации, которые также имеют некоторые недостатки, в частности, невозможность получения точного количественного результата, так как учет проводится визуально и поэтому достаточно субъективен [107].

В настоящее время интенсивно разрабатываются методы иммунофер-ментного анализа, которые по сравнению с другими способами детекции антител обладает следующими преимуществами:

высокой чувствительностью, которая определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;

возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;

экспрессностыо;

полной безопасностью определений;

стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА;

простотой проведения реакции;

наличием как визуального, так и инструментального учета.

Высокая производительность метода, возможность унификации и стандартизации диагностических тест-систем, а также автоматизация учета результатов делают ИФА предпочтительным при проведении массовых серологических исследований.

В отечественных иммуноферментных тест-системах и большинстве зарубежных, рассчитанных на определение антител различной специфичности в сыворотках крови человека, а опосредованно и антигенов, применяют конъюгаты антивидовых антител (против иммуноглобулина G человека) с ферментами-маркерами. Однако способ получения антивидовых антител,

включающий использование животных, достаточно трудоемок и длителен по времени.

Перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидин-биотин [107, 221, 233, 240]. Исследователи отмечают, что при использовании этих конъюгатов достигается чрезвычайно высокая чувствительность и специфичность определения, а также в значительной степени снижаются фоновые реакции [107, 275].

В качестве универсального детектора в ИФА используется белок А стафилококка, меченный ферментом. Универсальность этого конъюгата объясняется уникальной способностью белка А образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека и различных млекопитающих [1,2].

В этой связи актуальны исследования по получению конъюгатов (простых в исполнении и доступных по цене) и создания на их основе иммуно-ферментных тест-систем, пригодных для массовых серологических исследований.

Цель исследования - экспериментально обосновать и сконструировать твердофазные иммуноферментные тест-системы для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) на основе ампли-фицирующего комплекса авидин-биотин.

Задачи исследования

1. Разработать эффективный и технологичный способ приготовления конъюгата.

2. Сконструировать оптимальные композиции иммуноферментных тест-систем на основе амплифицирующего авидин-биотинового комплекса.

3. Оценить качество разработанных тест-систем по следующим критериям: линейность и параллелизм, чувствительность, специфичность, точность, сравнение с референс-методами.

4. Определить область применения разработанных иммуноферментных тест-систем.

Научная новизна

5. Впервые предложен универсальный антиглобулиновый маркер на основе белка А золотистого стафилококка, меченного биотином. Показана возможность эффективного применения сконструированного конъюгата для определения антител различной специфичности (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) в сыворотках крови человека и животных.

6. Экспериментально обоснована и разработана оригинальная конструкция иммуноферментной тест-системы для выявления анти-HBs с использованием биотинилироваиного конъюгата на основе рекомбинантного HBsAg (патент № 2206095 от 10.06.03 г.).

7. Впервые разработана оригинальная конструкция иммуноферментной тест-системы для определения коклюшных антител на основе биотинилироваиного белка А (приоритетная справка № 2006127549 от 31.07.2006 г.).

Практическая значимость работы

8. Разработана технология приготовления универсальных конъюгатов на основе биотинилированных белка А и рекомбинантного HBsAg, не требующая больших экономических затрат.

9. Разработана и утверждена нормативно-техническая документация на производство тест-системы иммуноферментной для выявления антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (Фармакопейная статья № 42-0504656005, Производственный регламент № 04862997-79-06). Получено регистрационное удостоверение (ЛС-000884 от 03.11.2005 г.) и лицензия на производство (99-04-000097 от 27.10.2005 г.).

10. Использование разработанных тест-систем обеспечивает эффективный серологический мониторинг за инфекциями, управляемыми средствами иммунопрофилактики, на основе количественной оценки уровня специфических антител.

11. Изданы и внедрены в работу территориальных отделов Управления Роспотребнадзора по Пермскому краю и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае» методические рекомендации «Эпидемиологический надзор и контроль за коклюшной инфекцией».

Положения, выносимые на защиту

12. Получены универсальные конъюгаты и сконструированы на их основе иммуноферментные тест-системы для индикации специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs).

13. Разработанные тест-системы соответствуют критериям, предъявляемым ВОЗ к наборам для иммунологических испытаний (линейность и параллелизм, чувствительность, специфичность, точность, сравнение с референс-методами).

14. Определена область применения разработанных иммуноферментиых тест-систем.

Похожие диссертации на Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) [Электронный ресурс]

Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антителВязникова Татьяна Владимировна

Конструирование комбинированных вакцин и иммуноферментных тест-систем для профилактики и диагностики управляемых инфекцийНиколаева Алевтина Максимовна

Получение и характеристика моноклинальных антител к трийодтиронину и создание тест-системы на их основеОкунева, Татьяна Олеговна

Получение моноклональных антител к адгезивному антигену К88 E. Coli и разработка на их основе диагностической тест-системыОспанова, Сауле Гельмановна

Разработка тест-систем иммуноферментного анализа для обнаружения вирусного антигена и специфических антител ротавирусов группы АТопурия, Теймураз Юзович

Разработка иммуноферментных тест-систем для количественного определения IgG-, IgG4-антител и их выявления при аллергической патологии человекаАгафонов, Виктор Евгеньевич

Твердофазная иммуноферментная тест-система для выявления антител к ретинальному S-антигену и ее использование в комплексном иммунологическом обследовании офтальмологических больныхЯковлева Валентина Германовна

Валидация количественных иммуноферментных тест-систем для контроля качества медицинских иммунобиологических препаратовДавлетбаева Ляйсан Раисовна

IL-4d2 - альтернативная форма IL-4: изучение структуры и разработка тест-системыБашкатова Юлия Николаевна

Получение иммунопотенциирующей системы на основе липосомальной формы бактериального липополисахаридаКошкина, Надежда Владимировна