Введение к работе
Актуальность проблемы. Рзеи<1о:!10лаг. mallei И ^seudoiuonas pcou(io:.ialloi являются возбудителями особо опасных для человека и животных гнойно-септических заболеваний - сапа и мелиои-доза, заканчивающихся в 85-100% случаев острого течения летальным ИСХОДОМ (Alexander A.D. et al., 1970; Dorff G.L. c-t al., 1971; Flick !.'..;<., Glui'i L.i,., 1976; Howe C. et al., 1,'71; Kanai K., 133o; .ucelaras&mee A., 1936). Заболевания носят очаговый характер и наиболее часто регистрируются в сранах Юго-Восточной Азии, Африки, Центральной Америки, Северной Австралии, однако интенсивно развивающиеся торговые связи, возросшая миграция лиц из эндемичных по этим заболеваниям районов не исключает возможности завоза данных инфекций в другие регионы (коропеп І.І.А. et ai.,1991). Необходимость раннего выявления P.pseudo:.iaiioi диктуется также подтверждением факта переноса мелиоидоза от человека к человеку ( KcCormic: J.:., et ai, 1975 ).
ґ. mallei и P.pseudoTnaliei занимают уникальное положение в группе I'seudononades вследствие их чрезвычайно высокой гомологии в строении ДНК и антигенном составе (Alexander A.D. et ali, 1970; Ashdown u.d., 1979, 1938, 1939; Cravitz ii., Iliiler '.. .:<., 1950; Handel L., 1966; Hedfearn U.S. et al., 1966; Ro„ui :,:. et al., 1970), поэтому применяемые обычно методы серологической диагностики, основанные, в частности, на использовании поликлональных антисывороток (иммунофлюоресцентный анализ, РИГА, латекс-агглютинация) практически не позволяют дифференцировать эти близкородственные виды возбудителей. Куль-туральные и биохимические тесты, включающие выделение культуры и дальнейшую ее идентификацию стандартными методами, поз-
В0ЛЯЮТ надежно Дифференцировать P. mallei И P.pseudoiiialj.ei і
однако в сроки, значительно превышающие допустимые, особенно в случае молниеносных форм заболеваний.
Поскольку иммунохимические методы, основанные на использовании моноклональных антител (МкАт), обладают исключительно высокой разрешающей способностью, представлялось перспективным получить МкАт, позволяющие с высокой степенью надежности идентифицировать и дифференцировать возбудителей сапа и мели-оидоза. Несмотря на то, что за последние годы во многих лабораториях мира получены моноклональные антитела ко многим антигенам, в том числе и бактериальным ( Yon^- L.s.,1935 ), в доступной литературе к началу проведения наших экспериментов обнаружить каких-либо данных о получении МкАт к p. mallei и P.pseudomaliei не удалось. Решению птой проблемы и посвящена наша работа.
Цель исследования. Получение МкАт к патогенным для человека и животных псевдомонадам ?.:aaiiei и P.pseudo:.iaHei и разработка методов использования препаратов на их основе в качестве диагностических реагентов для выявления и дифференциа-* ции возбудителей данных видов.
Задачи исследования:
-
Разработать эффективную схему иммунизации мышей сапным и мелиоидозным антигенами для получения спленоцитов пригодных для создания гибридом, продуцирующих специфические МкАт.
-
Разработать систему иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления МкАт к антигенам сапа и мелиоидоза.
-
Получить гибридные клоны-продуценты антител к антигенам сапа и мелиоидоза.
-
Изучить специфичность полученных МкАт, их основные
свойства.
-
Отобрать технологичные клоны гибридом для массового культивирования их в организме животных и получить МкАт в препаративных количествах.
-
Оценить возможность приготовления диагностических препаратов для выявления патогенных псевдомонад и их антигенов.
Научная новизна.
Впервые получены клоны гибридом и продуцируемые ими МкАт специфичные к видовым антигенам возбудителей сапа и мелиоидо-за; разработаны методы получения диагностических реагентов для выявления данных видов микроорганизмов и их антигенов в различных иммунохимических реакциях ("сэндвич"-вариант ИФА с использованием одного типа МкАт, прямой и непрямой варианты иммунофлгооресцентного анализа, РИГА, двойная иммунодиффузия в геле).
Практическая значимость.
Штаммы гибридных культивируемых клеток Миз muscuius L. -продуценты МкАт к г.mallei и p.pceudomaliei - депонированы в "Банке клеточных культур" института цитологии РАН (ВСКК) с присвоением авторских наименований соответственно ММ-Р.м.1 , ММ-Р.рм.1 и ММ-Р.рм.2 под номерами ВСКК II 275 Д.ВСКК II 276Д и ВСКК II 388 Д. По заявкам на изобретение получены авторские свидетельства ( № I79I45I и № I79I450 ).
Разработаны инструкции по изготовлению, контролю и применению препаратов МкАт для выявления и дифференциации P.mallei и P.pseudomaiiei , утвержденные директором НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Семеновым В.Ф.
Штаммы переданы в Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт, ведущий институт по исследованию па-
тогенных псевдомонад, для наработки антител и приготовления на их основе серийных диагностических препаратов для идентификации возбудителей сала и мелиоидоза и их антигенов. Положения, выносимые на защиту:
-
Полученные МкАт ММ-Р.м.1, MM-Р.рм.І, ММ-Р.рм.2 и ММ-Р.рм.З обладают выраженной видовой специфичностью в отношении типичных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, а также атипичного пуринзависимого штамма P.pseudomaj.iei vpa.
-
Диагностические реагенты, приготовленные на основе полученных МкАт, позволяют с высокой специфичностью идентифицировать и дифференцировать возбудителей сапа и мелиоидоза и их антигены в иммунофлюоресцентном анализе, "сэндвич"-вари-анте ИФА с использованием одного типа МкАт, агглютинационном и иммунопреципитационном тестах.
Структура диссертации.
Диссертация изложена на ИЗ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 97 источников. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 16 рисунками.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова ( Москва , 1990 ); конференции молодых ученых Пермского НИИ вакцин и сывороток ( 1990 ); II Всесоюзной конференции " Современные направления создания медицинских диагностикумов" ( Москва , 1990 ).
Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.
Работа по получению МкАт к типичным штаммам возбудителей сапа и мелиоидоза и атипичному пуринзависимому штамму P.pseudo-іінЛеі VPA выполнена на базе лаборатории клеточных гибридов НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова совместно с Волгоградским НИПЧИ и Любучанским институтом иммунологии, располагающими коллекцией музейных штаммов возбудителей и препаратами антигенов.
В работе использовали традиционные методы гибридомной технологии, иммунохимические и хроматографические методы.
Эксперименты проводили на мышах линии ваъз/с и гибридах PI CbalB/cх A/sn) массой 14-20 г.
В качестве антигенов использовали убитые 0,5% раствором формалина микробные клетки типичных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и их ВСЭ, а также ВСЭ атипичного пуринзависи-мого штамма P.pseudonaiiei vpa . Для определения изотипа МкАт использовали кроличьи антисыворотки против мышиных иммуноглобулинов А, И, G, G1, G2a, G2b, 33.
Схему иммунизации мышей пригодную для получения сплено-цитов способных при слиянии с миеломными клетками образовывать гибридные клетки, продуцирующие специфические МкАт, разрабатывали с учетом проведенных ранее экспериментов по получению МкАт к бактериальным антигенам (Кожевникова Е.В., 1989; КотоваЛ.Ю., 1991; Bach I.I.-A. and Hoffenbach А.А., 1983; De Boer 5.Н. and Vieczorek A., 1934; Bundesen P.G. et al., 1985; Lara J.5. et al., 1937; Luk J.i.!.C. et al., 1990).
-В качестве злокачественного партнера для гибридизации использовали миеломную клеточную линию РЗ Х63 Ag8.653 (np), дефектную по активности фермента ГГФРТ" и, вследствие этого,
не растущую на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин, ти-мидин (ГАТ). Для культивирования миеломных и гибридных клеток использовали среды НйЛ-1640 ("Serva", ФРГ) и Искова и Хэма с ІС$ СПК и другими ингредиентами; селективную среду ГАТ и переходную к обычной среду ГГ. Для отмывания клеток использовали бессывороточные среды RPH1 -1640, Игла, раствор Хэнкса.
Для удаления возможных ГГ$РТ+ ревертантов миеломных кле-^ ток в культуры добавляли 8 азагуанин до концентрации 20мкг/мл и культивировали в такой среде 10-14 дней.
Жизнеспособность миеломных и гибридных клеток оценивали с помощью суправитального окрашивания 0,2%-ным трипановым синим. Подсчет клеток приводили в камере Горяева.
В качестве фидерных клеток использовали спленоциты в концентрации 5*10 клеток на планшет или клетки перитонеального смыва той же концентрации.
В качестве сливающего агента использовали стерильный раствор 50% (вес/объем) полиэтиленгликоля ("Serva", ФРГ) молекулярной массой 1550.
Гибридизацию клеток, последующее культивирование, первичный скрининг, клонирование, массовое культивирование гибридом-продуцентов "ин витро" и "ин виво", замораживание и размораживание миеломных и гибридных клеток, а также очистку МкАт с помощью насыщенного раствора сульфата аммония проводили принятыми в лаборатории методами, описанными в "Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов моноклональных антител к бактериальным антигенам" (Москва, 1986).
Изотип МкАт определяли методом встречной радиальной им-мунодиффузии в геле по Ухтерлони (1948).
Препараты биотинилированных МкАт готовили на основе гамма глобулиновых фракций асцитных жидкостей, содержащих МкАт в 6
концентрации 10-12 мг/мл и диализованных против 0,1 Ы'КББ рН 8,0 - 8,5. Для этого 10 мг биотин-N -гидроксисукцинимидного эфира ("fierce", США) растворяли в 250 мкл диметилформамида ("Serva", ФРГ) и 50 мял полученного реагента при перемешивании добавляли к I мл препарата МкАт. Смесь инкубировали в. течение 2 часов при 20С и диализовали против ФСБ. Диализованные препараты биотинилированных МкАт стабилизировали глицерином с добавлением 0,1^ азида натрия.
Препараты моноклональных ФИТЦ-коныогатов готовили, смешивая 0,7 г% белка препарата очищенных МкАт с 3 частями флгаорох-рома. От несвязавшегося с белком ФИТЦ избавлялись хроматогра-фированием реагента на колонке с сефарозой Q 50. Меченые антитела концентрировали при помощи ПЭГ 20 000 ("Serva", ФРГ).
Эритроцитарные МкАт-диагностикумы готовили по методу Каральника Б.В. (1976).
Для приготовления ультразвуковых дезинтегратов (УЗД) использовали типичные штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза, а также штаммы синегнойной палочки F-I, Г-б, 868 и 1700/5, разведенные физиологическим раствором до концентрации 10 м.к./мл. Суспензии подвергали действию ультразвука трижды по 3 минуты на дезинтеграторе " Virsonic" модель 16-850. Полученные УЗД центрифугировали при 8000 об./мин в течение часа, надосадки отбирали и использовали в качестве антигенов при постановке ИФА.
ИФА проводили в соответствии с общепринятыми принципами. При постановке "сэндвич"-варианта использовали один тип МкАт как в качестве подложки при сенсибилизации планшета, так в качестве маркера в виде биотинилированных антител с последующим использованием коныогата авидин-пероксидаза в рабочих разведениях, выявляемыми субстанциями при этом являлись как микробные
клетки возбудителей, так и их растворимые антигены.
Иммунофлюоресцентный анализ (непрямой и прямой варианты) проводили на стеклах с предварительно фиксированными микробными клетками возбудителей с использованием либо препарахв гамма- глобулиновых фракций асцитных жидкостей, содержащих МкАт, с последующим проявлением реакции кроличьим антимышиным глобулином меченым ФИТЦ (непрямой вариант), либо моноклональных ФИТЦ-конъюгатов (прямой ИФлА). Учет реакции проводили под масляной иммерсией в люминесцентном микроскопе.
Реакцию непрямой гемагглютинации проводили общепринятым способом.
При постановке иммуноэлектрофореза(ИЭФ) использовали 1,2% агарозу (" Зіо Rad"), приготовленную на барбиталовом буфере. Электрофорез проводили в течение 1,5 часов при 260 в.
Электрофоретическое разделение препаратов ВСЭ возбудителей сапа и мелиоидоза в тонком слое 10 полиакриламидного геля (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) в буферной системе Лэммли (1970) проводили при 200 В при прохождении, проб в концентрирующем геле и 250 В - в разделяющем. После электропереноса препаратов на нитроцеллюлозную мембрану прово- ' дили иммуноблоттинг с МкАт ММ-Р.м.1.
ОчИСТКу IgG ПРОВОДИЛИ На КОЛОНКе С СОрбеНТОМ DSAE-Affi-sel blue IgG purification gel фирмы "Bio-Had" (США) по методу 3ruck с et ai. (1979) в модификации; очистку I^ii проводили на колонках с конканавалин -А сефарозой (" Pharmacia".Швеция).
