Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Иммунюбиолопіческие свойства природньк полипептидов (Обзор литературы)
Природные полипегпиды и их синтетические производные как потенциальные иммуномодулягоры
Характеристика основных возбудителей гнойных ран и роль пептидов в воспалительном процессе
Вфмикультура-какисточітикприрод 35
Глава 2. Материалы и методы 44
Глава 3. Иммуномодулируюі \ая активность, аллергенность разработанных таблеток Вермин
3.1. Получение таблеток 67
Оценка иммунобиологической активности таблетокВермин 71
Оценка острой и хронической токсичности 71
Изучеше аллергенной активности 73
Хагштфистикаиммуномодулирующейа модели системного иммунного ответа
Влияние на реакцию іжіерчувствиіелшс стизамедлешоготиш 79
Характфистикаиммунотрогшойактиішоститао условиях индуцированной циклофосфамидом иммуюсупрессии
Характеристика иммунотропной активности таблеток Вермин. в условиях иммобилизационного стресса
Глава 4 Иммунотропное действие разработанной мази Вермин для ингравагинального применения
Разработка мази Вермин для иніравагинального применения 91
Оценка иммунотропной активности мази Вермин на модели локального 95 иммунного ответа при интраваганальном применении
Изучение влияния мази Вермин на массу и клеточность центральных и 05 периферических органов иммунной системы крыс
Оценка влияния мази Вермин на показатели гуморального иммунного 95 ответа
Характеристика влияния мази Вермин на форменные элементы 98 периферической крови и фагоцитарную активность нейтрофилов
Изучение влияния мази Вермин на фагоцитарную активность клеток 100
селезенкииретионарньклимфатическихузлов
Глава 5. Иммуномодулирующая активность мази Вермин на модели гнойной раневой инфекции
5.1. Создание мази Вермин для лечения гнойных ран 104
5.2. Оценка иммунобиологической активности мази Вермин в 108
экспфиментальной модели гнойных ран
Патофтиотопмеские псйсазатели течения гжеюйвдфекции 108
Характеристика клеточных элементов и фагоцитоза в ране 110
Идеитфикация и количественное определение микробов в ране . Гистологаческаяхагжтфистикараневых биоптатов 116
Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови
Влияние мази на гуморальный иммунный ответ 119
Глава 6. Иммуномодулирующие эффекты Вермина в системе in vitro
6.1. Оценка влияния таблеток Вермин на пролиферацию Т - лимфоцитов in vitm 62.
Изучение влияния субстанции и мазей Вермин на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови практически здоровых людей добровольцев в эксперименте in vitro
Обсуждение
Выводы 142
Список литературы
- Характеристика основных возбудителей гнойных ран и роль пептидов в воспалительном процессе
- Хагштфистикаиммуномодулирующейа модели системного иммунного ответа
- Изучение влияния мази Вермин на массу и клеточность центральных и 05 периферических органов иммунной системы крыс
- Идеитфикация и количественное определение микробов в ране
Введение к работе
Актуальность проблемы Создание препаратов, обладающих иммунокорригирующей активностью, является важной задачей в практической иммунологии. Из отечественных имму-номодуляторов, уже внедренных в лечебную практику, заслуженное признание получили миелопид, полиоксидоний, имунофан, ликопид, рибомунил, лейкинферон и др. (Кузнецов и др., 1996; Борисова и др., 1998; Лебедев, 1999; Михайлова, 2001,2003; Хаитов и др., 2003). Однако все еще существует необходимость дальнейшего поиска и испытания новых иммуномо-дуляторов, действующих избирательно на отдельные звенья иммунной системы и являющихся безопасными лекарственными средствами. Это вызвано ростом частоты вторичных имму-нодефицитных состояний, аллергических и аутоиммунных заболеваний. Практически важен поиск новых сырьевых источников для производства препаратов, регулирующих функции иммунной системы (Запорожец, 2004). В настоящее время возрос интерес к биологически активным препаратам пептидной структуры и их влиянию на иммунную систему (Черепшеваи др., 2004; Гаврилова, 2006; Гумен и др., 2006; Милешина и др., 2006; Розенберг и др., 2006). Работы по изучению иммунобиологических свойств пептидных препаратов при пероральном, локальном, наружном применении немногочисленны, не содержат достаточных сведений и в большей мере относятся к применению пептидных препаратов в виде интраназальных растворов (Снимщикова и др., 2006). Это положение, а также анализ сырьевой базы и технологических аспектов получения иммуномодулягоров пептидной природы - Ганглиина (Петров и др, 1991; 1993), Молокина (Казьянин, 1998), Вермина (Кашина, 1998,1999), Микростима (Чисто-хина, 2004; Сафонова, 2006), разработанных в Пермском НПО «Биомед», выявили целесообразность дальнейших исследований в направлении создания новых лекарственных форм препаратов этой группы для перорального и местного применения.
Цель настоящего исследования - изучение иммуномодулирующей активности препарата Вермин, содержащего полипептиды из биомассы гибрида красного калифорнийского дождевого червя, при пероральном его введении в форме таблеток и наружном применении в виде мази.
Основные задачи исследования
Исследовать иммуномодулирующую активность, аллергенность, острую и хроническую токсичность таблеток, созданных на основе препарата Вермин.
Исследовать иммунотропное действие разработанной мази Вермин при интраваги-нальном применении.
Оценить иммуномодулирующую активность мази Вермин на модели гнойной раневой инфекции.
Оценить иммуномодулирующие эффекты таблеток и мази на пгюлиферативный ответ лимфоцитов и фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови в системе in vitro.
Основные положения, выносимые на защиту
Разработанные на основе препарата Вермин таблетки не обладают общетоксическими и аллергенными свойствами, проявляют выраженную иммуномодулирующую активность, восстанавливают нарушенные показатели иммунитета при экспфиментальном иммунодефиците и стрессе.
Разработанная на основе препарата Вфмин мазь с дифильно-абсорбционными свойствами стимулирует антителообразование и фагоцитоз при локальном иммунном ответе в условиях интравагинального введения.
Разработанная на основе препарата Вфмин мазь с гидрофильными свойствами при нанесении на гнойную рану оказывает ранозаживляющее действие, активирует поглотительную способность фагоцитов.
Таблетки и мазь Вфмин проявляют иммуномодулирующую активность в экспфи-ментах in vitro.
Научная новизна. Исследованы механизмы иммуномодулирующего действия таблеток и мази, разработанных на основе полипептидного препарата Вфмин. Установлено стимулирующее влияние таблеток Вфмин на системный иммунный ответ, активность фагоцитирующих клеток у животных с ненарушенными функциями иммунной системы, их способность корригировать степень выраженности экспфиментального иммунодефицита при цитостати-ческом воздействии и иммобилизапионном стрессе. Оптимизирован состав мази Вфмин на дифильно-абсорбционной основе для интравагинального применения. Выявлено иммуностимулирующее действие мази на антителообразование и фагоцитарную активность в подвздошных и паховых лимфатических узлах и фагоцитарную активность нейтрофилов пфиффиче-ской крови на модели локального иммунного ответа у крыс популяции Wistar. Разработан оригинальный способ получения мази Вфмин на гидрофильной основе. Установлено, что применение данной мази приводит к сокращению сроков лечения раневой гнойной инфекции, повышению активности фагопигирующих клеток.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о принципиальной возможности использования природных полипептидов для создания новых препаратов, обладающих иммуномодулирующей активностью. Показана эффективность разработанных лекарственных форм препарата Вфмин (таблетки, мазь) при коррекции вторичных иммунодефицитных состояний и гнойной инфекции. Мазь Вфмин для интравагинального применения рекомендуется для дальнейших клинических испытаний при гинекологических заболеваниях. На исследуемые таблетки и мазь разработаны проекты нормативной документации.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на П Международной конффенции, посвященной 100-летию Пфмского НПО «Биомед», Пфмь, 1998; П Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Санкт-Петербург - Валаам, 1998; Международной конференции «Фармация в XXI веке: инновации и традиции», Санкт-Петербург, 1999; 14-ой Коми республиканской молодежной научной конференции, Сыктывкар,
2000; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвященной 95-летию Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова ГУЛ «Иммунопрепарат», Уфа, 2000; Научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2001; X Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2006», Санкт-Петербург, 2006; Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора НН. Кеворкова «Иммунитет и аплфгия: от экспфимента к клинике», Пфмь, 2006; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совфшенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006.
По теме диссертации опубликовано 11 научных работ. Получен Патент на изобретение Российской Федфации №2180574.
Диссертация доложена и обсуждена на Научно - техническом совете филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пфмское НПО «Биомед», совместном заседании проблемной комиссии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и Пфмского отделения Российского научного общества иммунологов.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 187 страницах машинописного текста, содфжит 7 рисунков и 47 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 439 литературных источников, из них 291 - отечественных и 148 - зарубежных авторов, 9 приложений.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории биологически активных препаратов в соответствии с планом НИР НИИ вакцин и сывороток филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пфмское НПО «Биомед» (номф государственной регистрации 01.9.90 002648).
Характеристика основных возбудителей гнойных ран и роль пептидов в воспалительном процессе
Характерной особенностью современной эпохи является чрезвычайное многообразие неблагоприятных факторов, воздействующих на организм человека: внешние повреждающие вещее та, в т.ч. ионизирующая радиация, СВЧ-излучение, токсические вещества, несбалансированное питание. Это приводит к снижению популяционнои иммунореактивности, истощению адаптационных и компенсаторных механизмов и, как следствие, к возникновению различных заболеваний и патологических состояний [15,28,33,184,188,260,330,331].
Эгиотропные методы лечения инфекций и традиционная цитостатическая терапия онкологических заболеваний, как правило, приводят к дальнейшей депрессии эффекторов иммунитета, что отражается на качестве лечения. В этих условиях коррекция вторичных иммунодефицитов открывает новые возможности повышения эффективности терапии и снижения риска хронизации инфекций [25,61,78, 79, 87,94, 112,129].
Сначала с помощью иммунологии человечество разработало систему профилактики инфекционных заболеваний, теперь на очереди стоит разработка системы профилактики основных неинфекционных заболеваний человека, при которой профилактические корригирующие воздействия на иммунную систему с помощью медикаментозных препаратов самого различного происхождения проводятся задолго до появления первых признаков основного заболевания [103].
Изложенное выше определяет актуальность разработки и внедрения в медицинскую практику новых эффективных средств и методов коррекции функций организма, повышения резистентности к неблагоприятным факторам [286, 362].
Поиски средств, воздействующих на восстановление иммунной реактивности организма, привели к использованию иммуностимуляторов различного происхождения: ферментных препаратов, полисахаридов бактериального происхождения, дрожжевых полисахаридов, вакцин, препаратов нуклеиновых кислот, пуриновьк и пиримидиновых производных, препаратов вилочковой железы, костного мозга и др. [ 92,136,207].
Преимущества перед другими имеют вещества растительного и животного происхождения, являющиеся естественными компонентами организма, обладающие умеренными модулирующими свойствами, малой токсичностью, лишенные побочных эффектов, длительно хранящиеся, эффективные при пероральном и местном применении [17,140,142,161 ].
Именно такими веществами являются природные полипептиды, выделенные из различных клеток, тканей, организмов [18,333 ].
В настоящее время описано несколько структурно-гомологичных групп антибиотических (антимикробных) пептидов (дефенсины, пекропины, протегрины, магейнины, бактенейцины), среди которых наиболее распространенным в эволюции семейством являются дефенсины [104, 105]. Пептиды этой группы впервые были выделены из нейтрофилов морских свинок в 1963 году. Молекулы дефенсиновой природы содержат и продуцируют также другие гемоциты, клетки эпителия пищеварительного, респираторного и мочеполового трактов и кожи человека. Локализация дефенсинов в фагоцитах и барьерных эпителиях свидетельствует в пользу их участия в формировании врожденного иммунитета в качестве универсальных пептидных антибиотиков эндогенного происхождения. Дефенсины фагоцитов и барьерных систем у животных и человека выступают эффективными антимикробными агентами, в значительной степени определяющими завершенность фагоцитоза и обеспечивающими инактивацию микроорганизмов на уровне клеточно-тканевых образований, пограничных с входными воротами инфекции [342,343].
За счет электростатических сил притяжения между протонированными гуанидиновой или є-аминогруппами дефенсинов и отрицательно заряженными компонентами микробных клеток (ЛПС, тейхоевыми кислотами, пептидогликанами, фосфатидилглицерином, кардиолипином) осуществляется сорбция пептидов на поверхности бактериальных и эукариотических клеток. В результате такого взаимодействия снижается трицательный заряд микробных клеток, что облегчает фагоцитоз. Подобные наблюдения послужили основанием для рассмотрения дефенсинов в качестве опсонизирующих микроорганизмы соединений [108]. Описана способность дефенсинов увеличивать проницаемость сосудов микроциркуляторного русла непосредственно и путем дегрануляции тучных клеток В опытах на мышах продемонстрирована хемотаксическая активность для нейтрофилов и мононуклеарных клеток дефенсинов человека HNP-1 и HNP-2, способность последних усиливать гуморальный иммунный ответ (IgG) на овальбумин. Авторы считают, что активируется секреция антимикробных пептидов и белков нейтрофилами цитокином ИЛ-8. Таким образом, в очагах воспаленьд дефенсины могут подавлять жизнеспособность микроорганизмов и проявлять свойства молекул, обладающих хемотаксической, опсонизирующей и адъювантной активностью [105]. В связи с этим, катионные пептиды, синтезируемые лейкоцитами человека в процессе интерфероногенеза, являются перспективным объектом для создания на их основе новых лечебных препаратов [37].
Система регуляторных пептидов состоит, как правило, из веществ эндогенного происхождения, которые обладают широким спектром биологической активности и локализованы во всех органах и тканях организма, что указывает на важное значение этих молекул в координации функций многоклеточного организма. Так, например, система натрийуретических пептидов, ответственных за поддержание водно-солевого равновесия и снижение гтоериального давления, включает предсердный натрийуретический пептид (ПНП), мозговой натрийуретический пептид (МНП), С-концевой натрийуретический пептид (С-НП). Из плазмы пациентов с хронической сердечной недостаточностью выделен дендроаспидньгй натрийуретический пептид, обладающий также вазодилятирующим и диуретическим эффектом [195].
Предлагается новый подход к классификации регуляторных пептидов и протеинов. Он основан на комплексе их свойств: стабильность, аффинность к рецепторам, существование специализированных предшественников, белков-транспортеров и т.д. Частично описаны очень стабильные факторы, такие как новое семейство пегаидовназьшаемьгхглипролиньї [299].
Хагштфистикаиммуномодулирующейа модели системного иммунного ответа
Исследования проводили для определения влияния субстанции Вермин на МІЖ и МБК антибиотика гентамицина сульфата. Дня определения антибактериальной активности применяли бульон на переваре Хоттингера. Конечная концентрация гентамицина сульфата в первой пробирке составляла 0,625 мг/мл. Микробную взвесь вносили в пробирки в виде суточной монокультуры S. aureus (штамм 25923), Ps. aeruginosa (штамм 27853), Escherichia coli (штамм 25922) или в виде микробной смеси: S aureus 80%, Ps. aeruginosa 15%, EColi 5% в концентрации 10 микробных клеток на 1 мл среды, которую устанавливали по оптическому стандарту мутности ГИСК им. J1A Тарасевича. Опыт сопровождали следующими контролями: питательная среда, среда с гентамицином сульфатом, среда с субстанцией Вермин, среда с соответствующими культурами тест-микробов. Дальнейшее определение проводили в соответствии с методическими рекомендациями [147].
Автор сердечно благодарит за помощь, оказанную в проведении микробиологических исследований старшего лаборанта лаборатории БАП НПО «Биомед» А.И. Лодейшикову. і Определение ашписть юстафилолизина
Скорость заживления раны или индекс JLH. Поповой, выраженный в процентах, рассчитывали следующим образом: (S-SK) X100(%), где, Sxt _ S - величина площади раны при предшествующем измерении, S« -величина площади раны в настоящий момент, t - число Проводили в соответствии с Методическими указаниями по определению антиальфастафилолизина в сывороточных препаратах крови человека и животных [148]. Планиметрия раны Для оценки скорости за: явления раны наносили ее контуры на прозрачную пленку с пскшедующим переносом на миллиметровую бумагу в сроки: до начала лечения, на 3-й, 7 , 12-е сутки [258, 259дней между первым и последующим измерением. Патоморфологический и гистологический анализ тканей и органов экспериментальных животных выполнен совместно с главным патологоанатомом г. Перми K.M.H. ЮА. Горбуновым. Микрофотосъемка гистологических препаратов проводилась совместно с сотрудником кафедры гистологии и эмбриологии Пермской государственной медицинской академии В А Князевым на микроскопе биологическом «Биолам» с микрофотонасадкой МФН-11. Коэффициент увеличения системы 92,4. Фотосъемка производилась с использованием фотопленки «Микрат-Н» (черно-белая) и «Kodak Pro Foto 100» (цветная).
Автор выражает глубокую благодарность всем принимавшим участие в исследованиях и за предоставгенную возможность проведения микрофотосъемки.
Оценка кислорс дозависимой бактерицидной активности нейтрофилов периферической крови и клеточных суспензий органов лимфомиелойдного комплекса
Оценку кислородозависимых механизмов мшфобшщцности проводили в модифицированном варианте [268, 269] спектрофотометрического теста [47, 48] с нитросиним тетразолием (НСТ-тест). В стимулированном варианте смешивали 25 мкл цельной крови, 12,5 мкл опсонизированного зимозана (Sigma, США, кощентрация - 3,0 мг/мл), 12,5 мкл забуференной полной питательной среды (1111С - среда 199 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10 мМ HEPES) и 25 мкл 0,15% раствора НСТ на 0,15 М растворе NaCl. В спонтанной пробе смешивали те же компоненты, но вместо зимозана добавляли 12,5 мкл 0,15 М раствора NaCl. В контрольные пробы вносили те же ингредиенты за исключением раствора НСТ, вместо которого добавляли 0,15 М раствор NaCl. При проведении НСТ-теста с суспензиями клеток органов (модификация ЮЛ Шилова с соавт.) [269] вместо крови - 50 мкл клеток, разведенных 1/2 на аутоплазме (т.е. 25 мкл клеток 10х106/мл +25 мкл аутоплазмы). Дальнейший ход определения не і отличался от описанного Гордиенко [47, 48], за исключением того, что объем всех реагентов был увеличен в 1,5 раза, что было связано с использованием отечественного спектрофотометра СФ-46 и кювет объемом 3 мл. Результаты выражали в виде абсолютных показателей оптической плотности (на 25 мкл крови), а также в виде условных относительных единиц, вычисленных по формуле: А/Вх10, где А -экетинкция пробы против контроля, полученная на спектрофотометре при 710 нм; В -абсолютное содержание фагоцитов в 1 мкл.крови (моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы).
Оценка влияния препарата Вермин на пролиферацию Т-лимфоцитов in vitro Использовали кровь 8 практически здоровых мужчин добровольцев в возрасте от 25 до 60 лет (средний возраст - 36,5 лет). Гепаринизированную кровь перемешивали и помешали в термостат при t = 37С на 60 - 90 мин. После отстаивания слой плазмы с лейкоцитами снимали и центрифугировали при 1500 об/мин. в течение 20мин. После центрифугирования надосадочную жидкость снимали, осадок ресуспендировали в 2 мл полной культуральной среды. Использовали микрометод культивирования лимфоцитов [242, 341] в пластиковых круглодонных 96-луночных планшетах (завод "Медполимер", Санкт - Петербург). Каждая культура содержала 2x10s клеток в ОД мл полной культуральной среды. Последнюю готовили ex tempore на HEPES (N-2-пщроксиэтилпиперазин-№2-этансульфоновая кислота, Serva), 100 мкг/мл гентамицина сульфата и 10% аутоплазмы. Показатели рН среды доводили 10% NaOH до 7,4 и стерилизовали основе среды 199 с добавлением 2 мМ L-глутамина (Reanal, Венгрия), 10 мМ ее фильтрованием через фильтры МШіроге (США). В качестве Т-клеточного митогена использовали фитогемагглютинин-П (ФГА, Sigma, L9132, США) в концентрациях 1,25; 2,5; 5; 10; 20; 40 мкг/мл. Препарат Вермин вносили в культуры сразу с момента их постановки (в конечных концентрациях 100 мкг/мл, 10 мкг/мл). Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5% СОг при t - 37С в течение 72 ч. За 18 ч. до окончания куггтивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи /метил тимидина в объеме 10 мкл. Содержимое каждой лунки последовательно осаждали на фильтры МіШроге (США) с диаметром пор 0,45 цт при давлении вакуумного насоса 0,5-1,0 атм., промывая каждую лунку 0,85% раствором натрия хлорида не менее 4-5 раз. Фильтры промывали для удаления несвязавшегося тимидина последовательно 5 мл 0,85% NaCl, 5 мл охлажденной до 4С 5% трихлоруксусной кислоты и снова 5 мл 0,85% NaCl. Радиоактивность проб определяли после высушивания фильтров. Интенсивность пролиферации оценивали по включению -метилтимидина. Величину включения последнего определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Бета-2" (Киевское НПО "Медаппаратура). При подсчете использовали сцинтилляционную жидкость следующего состава: 4 г ППО (2,5-дифенилоксазол), 0,05 г ПОПОП (1,4-бис[5-фенил-2чжсазолил]-бензен; 2у2 -п-фенилен-бис[5-фенилоксазол]), 900 мл толуола для спектроскопии, 100 мл этанола. Для стандартизации результатов эффективность счета контролировали с использованием стандартов /метил - YL
Исследования проводили в радиоизотопном подразделении аналитической лаборатории ИЭГМ УрО РАН. Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам лаборатории. Изучение влияния препарата Вермин на фагоцитоз in vitro Целью настоящего исследования является определение диапазона кощентраций субстанции и мази Вермин на дифильно-абсорбционной и гидрофильной основах, оказывающих влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов человека в условиях in vitro. Использовали цельную гепаринизированную кровь. 10 практически здоровых людей добровольцев в возрасте 25 до 60 лет (из них 5 женщин на 6-10 сутки менструального цикла и 5 мужчин). Влияние препарата на фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали в эксперименте in vitro с использованием модифицированного метода B.R Каплина [85]. В опытных пробах 25 мкл крови преинкубировали с 12,5 мкл различных концентраций субстанции и экстракта из мази Вермин на полной питательной среде (1111С) в течение 1 ч при =37С в пластиковых микропробирках с антиадгезивным покрытием. В контрольные пробы вместо препарата Вермин вносили 12,5 мкл 1111С. Затем во все пробирки вносили по 12,5 мкл ФЭБ (200х106/мл ППС). Пробы инкубировали 20 мин при f=37C. В мазках, окрашенных по Романовскому, учитывали показатели нейтрофильного фагоцитоза - процент фагоцитирующих нейтрофилов, фагоцитарное число, фагоцитарный индекс.
Изучение влияния мази Вермин на массу и клеточность центральных и 05 периферических органов иммунной системы крыс
Как видно из табл. 9, у коглрольных мышей число АОК в селезенке составляет 68,08 на 106ЯСК или 28954 на орган. При определении титра антител на 5-е сутки опыта было выявлено, что уровень гемаїтлютининов у контрольных мышей (в виде офицательного log2 титра антител) равен 8,6+033. На фоне перорального введения таблеток Вфмин отмечена стимуляция гуморального иммунного ответа, которая проявилась в дозе 0,25 мг/кг, о чем свидетельствует увеличение количества АОК в абсолютном выражении и титра.гемагглю-тинируюших антител (по log2 обратного титра) на 5-е сутки
Характеріюпитвтіяміятфазоцішві Традиционным и общепринятым для учета показателей фагоцитарной активности крови является расчет только интегральных относительных показателей: процента фагоцитоза, фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса. Дополнительно предлагается расчет процента так называемых активных фагоцитов (захвативших более двух объектов фагоцитоза) и расчет абсолютных показателей нейтрофильного фагоцитоза [267].
Как видно из табл. 10, эффект стимуляции таблетками Вермин фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови в модели системного иммунного ответа отчетливо проявляется какв гагс)Сительном,такиабсхшЕСітномвьіражении.
Влияние таблеток Вермин на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов периффической крови мьшіей в модели системного пфвич-ного иммунного ответа Экспери- Доза Коли- Процент Фагоци- Фагоци- Процент Абсолютное Абсолютное Абсолютное ментальное воздействие препарата, мг/кг чество наблюдений фагоцитоза тарное число тарный индекс активных фагоцитов число фагоцитирующих ней-трофилов, xlOftn число активных фагоцитов, х10% число фагоцитированных объектов, х10?/л
Поскольку в будущем предполагается использование таблеток Вермин для коррекции иммунных реакций в условиях патологии, представлялось необходимым исследование им-муномодулирующей активности не только в условиях неизмененного иммунного ответа, но и на модели приобретенного иммунодефицита. В экспериментальной иммунопатологии для скрининга потенциальньгх иммуьомодуляторов общепризнана модель иммунодефицита, индуцированного введением циклофосфамида (ЦФ). Несмотря на постоянное совершенствование средств и методов поддерживающей (сопровождающей) терапии, цитосупрессия, индуцированная химиотерапевтическими препаратами, продолжает оставаться серьезной проблемой, ограничивающей эффективность комбинированного и комплексного лечения больных онкологического профиля [89,128].
В нашем эксперименте у контрольных мышей, иммунизированных эритроцитами барана и не получавших циклофосфамид (контроль 1), на 5-е сутки первичного иммунного ответа количество лейкоцитов в крови составляет (хіо /л) 8,4210,70, палочкоядерных ней-трофилов-0,3710,08, сегменгоядернькнейтрофилов-1,16+0,15, эозинофилов-0,10+0,02, моноцитов - 032±0,04, лимфоцитов 6,47±0,59. Однократное введение ЦФ животным (контроль 2) приводит к снижению общего количества лейкоцитов (табл. 12), в основном за счет развития абсолютной лимфопении, развитию относительного и абсолютного нейтрофиль-ного лейкоцитоза с регенеративным сдвигом влево, а также моноцитоза (табл. 13,14). Развитие нейтрофильного лейкоцитоза и моноцитоза в условиях цитостатического повреждения костномозгоюго кроветворения циклофосфамидом может быть связано с увеличением про-дукции кшоние лимулируюіцих факторов [46].
Как видно из табл. 12, влияние таблеток Вермин на показатели белой крови в обеих из апробируемых доз проявляется восстановлением сниженного ЦФ количества лейкоцитов. Таблетки Вермин в дозе 0,025 мг/кг спссобствуют снижению количества моноцитов в относительном выражении и увеличению абсолютного количества лимфоцитов в сравнении с контролем 2 (табл. 13,14). В дозе 0,25 мг/кг таблетки также увеличивают абсолютное коли-чество лимфоцитов и предотвращают вьізьіваемьюциклсфссфамидоммоноцитш(табл. 14).
Экспериментальное воздействие Доза препарата, мг/кг Количество наблюдений Количество лейкоцитов крови,х10%
Как видно из табл. 15, ЦФ в использованной дозе вызывает выраженный иммунодефицит, проявляющийся в снижении абсолютного и ошосигельного числа АОК в селезенке и титра антител. Таблетки Вермин, вводимые пероральыо через сутки после введения цитостатика, отменяют индуцированную депрессию гуморального иммунного ответа. Статистически значимо по сравнению с контролем 2 (ЦФ) действие препарата проявляется в дозе 0,25 мг/кг в отношении количества АОК на селезенку и титра гемаїтлютининов, в дозе 0,025 мг/кг - титра гемаїтлютининов (табл. 15).
Введение ЦФ приводит к снижению ошосигельной массы тимуса мышей в 2 раза, количества тимоцитов в 3 раза, в сравнении с аналогичными показателями у животных, не получавших иммунодепрессант (контроль 1). Таблетки Вермин в обеих дозах нивелируют, вызванное введением циклофсюф мида, снижение массы и клеточности тимуса (табл. 16).
Идеитфикация и количественное определение микробов в ране
Не исключено, что эффект препарата в широком диапазоне доз на развитие гуморального иммунного ответа к эритроцитам барана связан с его влиянием на регуляторные Т-лимфоциты. В настоящее время доказано, что в реализации иммунного ответа на большинство антигенов участвуют три субпопуляции регулятррных Т-лимфоцитов: ТЫ, Th2 и ThO [60,400]. По отношению друг к другу субпопуляции ТЫ и Th2 выступают как супрессорные клетки. При анализе полученных результатов обращает на себя внимание и увеличение под действием препарата числа лимфоцитов в тимусе. Вероятно, имеет место влияние препарата на процессы антигеннезависимого созревания Т-лимфопитов в тимусе. В будущем представляется необходимым выяснение конкретных механизмов такого эффекта, который потенциально может реализоваться через изменения продукции гормонов тимуса и/или регуляцию соотношения процессов апоптоза и выживания клеток для дальнейшей дифференцировки в тимусе.
Выраженная иммуномодулирующая активность таблеток Вермин обнаружена и в модели лекарственного иммунодефицита, индуцированного циклофосфамидом, где препарат предствращает снижение клеточности тимуса, восстанавливает гуморальный иммунный ответ, повышает сниженное ЦФ общее количество лейкоцитов, при этом увеличивая абсолютное количество лимфоцитов и предотвращая вызываемый ЦФ моноцитоз, что проявляется снижением относительного и абсолютного количества последних. Алкилирующие агенты относятся к наиболее широко распространенным антропогенным генотоксическим соединениям, загрязняющим окружающую среду. В то же время препараты, обладающие алкилирующей способностью, такие как мелфалон, ццсдиаминодихлфшютина, соединения нитрозомочевины, миокломин и чаще всего циклофосфан, интенсивно используются в терапии злокачественных новообразований [46]. После курса химиотерапии и в лимфоцитах, и в нейтрофилах больных происходит значительное увеличение повреждений и угнетение метаболизма в целом 212,281].
Наряду со специфическими кроветворными (колониестимулирующими) ростовыми факторами, в качестве средств поддерживающей терапии внимание исследователей продолжают привлекать также неспецифические вещества, которые могут стимулировать механизмы физиологической защиты системы гемо-, иммунопоэза от ігитотоксических влияний. Это обеспечивает защиту кроветворных клеток костного мозга, восстановление количества циркулирующих клеток периферической крови [34],
Общеизвестно, что циклофосфамид, являясь алкилирующим агентом, приводит к преимущественному повреждению популяций интенсивно делящихся клеток Учитывая, что таблетки Вермин вводили после инъекций циклофосфамида, в основе предотвращения клеточного опустошения тимуса и уменьшения числа Т-лимфоцитов в селезенке может лежать механизм стимуляции пролиферации и дифференцировки покояпіихетклеток-предшественникоа
Особенно важно, что таблетки Вермин восстанавливают активность нейтрофилов периферической крови, сниженную введением циклофосфамида. Подобный эффект может быть связан с восстановлением под действием препарата пула интенсивно пролиффирующих мононуклеарных фагоцитов, который в условиях введения ЦФ элиминируется.
Интересным является установленный факт увеличения клеточности селезенки при введении препарата на фоне действия ЦФ. Этот эффект проявляется как при парентеральном введении препарата Вермин [91], так и при пероральном введении таблеток Вермин и, вероятно, иллюстрирует защитньгй механизм, существующий в организме, и заключающийся в стимуляции экстрамедуллярного кроветворения (в селезенке) для восстановления подавленного гемопоэза при химиотерапии [23].
На наш взгляд, заслуживают внимания данные по влиянию таблеток Вермин на организм животных, подвергнутых нетравматическому стрессу. В качестве экспфиментальной модели нами выбрана модель иммобилизационного стресса, предложенная Г. Селье [193]. В данной модели сочетаются эмоциональный и физический стресс. Иммобилизация, использованная в качестве модели изучения активности фармакологических средств, выступает в такой ситуации как стресс переходящий из общего звена адаптации в неспецифическое звено патогенеза «сгрессорных» заболеваний. Запуск стресс - реалгоующих систем под воздействием сильного раздражителя вызывает изменения функционирования иммунной системы, которые могут проявляться разнонаправленными реакциями адаптивного иммунитета и неспецифических факторов зашиты [38, 270]. Изучение активности таблеток показало, что препарат препятствует стресс-индуцированному опустошению тимуса. Адаптивное действие таблеток Вермин к стрессу проявляется и в повышении сниженных показателей фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови. Складьтается впечатление, что таблетки Вермин обладают общим стресс-протекгивным действием
Выдвинутая концепция о существовании двух различных адаптационных стратегий: резистентной (стрессорной) и толерантной [115], имеет достаточно четкую корреляцию с разделением факторов, участвующих в развитии в организме стресс-реакции, на две системы - стресс - реализующей и стресс - протективной. Для резистентной стратегии типичны увеличение потребление кислорода и активация катаболизма, она реализуется в основном катехоламинами (через J$- и аг адренорецепторы) и глюкокортикоидами, а также глюкогоном, паратиреоидином, альдостероном, лейкотриенами Для толерантной стратегии характерно снижение потребления кислорода и катаболизма (антикалоригенной эффект). Такой эффект реализуется аденозином через А-рецепторы, серотонином через Si-рецепторы, катехоламинами через агадренорецепторы, дофамином, гамма-аминомасляной кислотой. Антикалоригенный эффект возникает и при введении в организм морфина, некоторых нейропептидов, например Р-эндорфина. Опиоиды снижают потребность организма в кислороде при экстремальных ситуациях, повышают устойчивость тканей к кислородному голоданию, сберегают энергетические запасы [266].
