Содержание к диссертации
Список сокращений и условных обозначений 4
Введение 5
Обзор литературы 13
Глава 1 Препараты иммуноглобулинов - их иммуномодулирующие и
противовоспалительные свойства 13
Глава 2 Функциональная активность разных клеточных систем
фагоцитарного звена иммунитета. Активация фагоцитарных клеток и
ее проявления 19
Глава 3 Участие свободных радикалов в формировании воспалительного и
иммунного ответа 26
Глава 4 Хемилюминесцентный метод исследования генерации активных форм кислорода и оценки процессов кислород-зависимого метаболизма в
фагоцитирующих клетках 31
Собственные исследования 36
Глава 5 Материалы и методы исследований 36
Глава 6 Исследование влияния препаратов иммуноглобулинов для
внутривенного введения на процессы свободно-радикального
окисления и хемилюминесценцию модельных систем 45
Глава 7 Влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функционально-метаболическую активность интактных и активированных фагоцитарных клеток в отношении различных
объектов фагоцитоза in vitro 50
Глава 8 Влияние различных концентраций препаратов иммуноглобулинов для
внутривенного введения на функционально-метаболическую
кислород-зависимую активность фагоцитарных клеток разных типов
in vitro 57
Исследование влияния препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на процессы кислород-зависимого метаболизма интактных полиморфно-ядерных фагоцитарных клеток крови 57
Воздействие препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на процессы кислород-зависимого метаболизма интактных макрофагов 62
Воздействие препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на процессы кислород-зависимого метаболизма активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов
из очага воспаления 64
8.4 Влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения
на процессы кислород-зависимого метаболизма активированных
мононуклеарных фагоцитов из очага воспаления 69
Глава 9 Изменения активности кислород-зависимого метаболизма
и генерации АФК полиморфно-ядерными лейкоцитами при влиянии препаратов иммуноглобулинов для внутривенного
введения in vivo 75
Заключение 79
Выводы 90
Практические рекомендации 92
Список литературы 93
Список сокращений и условных обозначений
ЛЗХЛ
пмял пол
СР СРО
I max
Tg G (М,А,Е)
ВВИТ
антиоксидант
антиокислительная активность активные формы кислорода
кислород-зависимый метаболизм
люминолзависимая хемилюминесценция
модельная система
мононуклеарные фагоциты
полиморфно-ядерные лейкоциты
перекисное окисление липидов
свободные радикалы
свободнорадикальное окисление
хемилюминесценция
максимальная амплитуда медленной вспышки
иммуноглобулин G (М,А,Е)
светосумма
иммуноглобулины для внутривенного введения
цитрат-фосфат-люминол
нитросиний тетразолий
Введение к работе
Актуальность проблемы
Среди наиболее эффективных средств, используемых в различных областях медицины, важное место продолжают занимать препараты различных иммуноглобулинов, в том числе и для внутривенного введения (ВВИГ) [2,7,80,117,168,192]. Широкое применение ВВРТГ определяет необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых методов их лечебно-профилактического использования, определения разных сторон биологической активности данных препаратов, оценки их эффективности при разной патологии. Ввиду возможности быстрого введения в организм значительной массы ВВИГ, они служат также эффективным средством неотложной коррекции у пациентов количественного дефицита содержания иммуноглобулинов. Известно, что ВВИГ обладают иммуномодулирующим и противовоспалительным действием, механизмы которых полностью не прояснены [30,120,194].
В настоящее время продолжает оставаться актуальным исследование процессов фагоцитоза, характеризующих наряду с другими защитными механизмами иммунной системы, способность организма противостоять инфекционным и другим факторам, в том числе вызывающим заболевания воспалительного характера [31,51,53,55,102,106].
Препараты иммуноглобулинов могут оказывать разноплановое действие. Одним из важнейших свойств этих биопрепаратов является способность влиять на разные виды клеток [127,140,149,164,205], и в том числе стимулировать процессы фагоцитоза [158,165,203]. Вместе с тем известно, что препараты ВВИГ обладают противовоспалительным действием, одним из компонентов которого является угнетение различных проявлений фагоцитарной активности клеток [172,177]. Так, препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения используются для купирования системного воспалительного ответа
[11,46,81,89,142] и явлений воспалений аллергической и аутоиммунной природы [3,30,57,79,89].
В процессе активации фагоцитов осуществляется целый ряд метаболических перестроек. Важнейшим механизмом, задействованным в процессах фагоцитоза является изменение активности кислород-зависимого метаболизма (КЗМ) и генерации свободных радикалов (СР) - активных форм кислорода (АФК) [21,24,25,38,87,88,98,108]. Интерес исследования данных процессов представлен в двух аспектах.
С одной стороны важным является оценка динамики кислород-зависимых процессов и генерации АФК, поскольку они выступают в качестве одного из критериев, отражающего изменения функционально-метаболической реактивности фагоцитов под действием различных факторов, что позволит охарактеризовать влияние препаратов ВВИТ на фагоцитарные механизмы. С другой стороны актуальным является оценка действия препаратов на сами процессы образования свободных радикалов АФК. Свободно-радикальное окисление (СРО) -фундаментальный биологический процесс, обеспечивающий нормальную жизнедеятельность, а процессы фагоцитоза являются одним из путей образования свободных радикалов в организме. СР имеют большое значение в развитии воспаления [87,113,181,182,209,212,213].
Так, АФК активируют белковый синтез, способствуют образованию хе-моаттрактантов, образуют эффекторное звено аппарата биоцидности фагоцитов, направленного на деструкцию и элиминацию патогенных факторов [50,51,98,102,115,167,170]. Однако, кроме своего физиологического значения
__У
АФК в избыточном количестве могут инициировать процессы перекисного окисления липидов, вызывать модификацию антигенов и повреждения молекул и клеток собственного организма, стать основой патогенеза многих заболеваний [98,102,175,181,183,186,197,207,212,213,214].
Известно, что многие ингибиторы свободно-радикальных реакций, оказывают выраженное противовоспалительное действие. Поэтому интерес пред-
7 ставляет оценка прямого влияния иммуноглобулиновых препаратов ВВИГ на
процессы образования свободных радикалов, а также опосредованного - через
взаимодействие с фагоцитарными клетками.
В настоящее время влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитные свойства фагоцитов определяется только в процессе их. лечебного применения in vivo [3,82]. Сведения о лабораторных методах оценки активности ВВИГ до их клинического применения отсутствуют.
В связи с этим, актуальна разработка экспресс-методов предварительной оценки влияния различных иммуноглобулиновых препаратов на функционально-метаболическую активность фагоцитов.
Перспективным способом оценки процессов кислород-зависимого метаболизма и генерации СР является регистрация сверхслабого свечения - хеми-люминесценции (ХЛ), дающим возможность непрерывно наблюдать за генерацией образования радикалов [22,23,96,97,99,100,138]. Хемилюминесцентные методы позволяют судить о влиянии различных препаратов на процессы СРО. Так, в экспериментах in vitro можно по изменению интенсивности ХЛ при добавлении препаратов в модельные системы, имитирующие наиболее распространенные в организме реакции СРО - образование активных форм кислорода и перекисное окисление липидов, изучить механизм их действия и определить антиокислительную активность (АОА) препаратов.
Исследование спонтанной и стимулированной ХЛ фагоцитарных клеток в последние годы используется для изучения их функционального состояния [8,33,37,92,118].
С учетом вышеизложенного, изучение изменений функционально-метаболической активности фагоцитов и генерации ими СР под влиянием препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения, а также определение антиокислительных свойств данных препаратов представляет научный и практический интерес.
8 Цель исследования
Оценить влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функционально-метаболическую активность фагоцитов и генерацию свободных радикалов.
Задачи исследования
Определить воздействие разных препаратов иммуноглобулинов на генерацию свободных радикалов активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в модельных системах.
Исследовать влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функционально-метаболическую активность и генерацию активных форм кислорода разными типами фагоцитов (интактные из крови и активированные из перитонеального воспалительного экссудата полиморфно-ядерные лейкоциты) при добавлении стимуляторов — объектов фагоцитоза in vitro, и возможность оценки влияния препаратов по изменениям этой интенсивности с помощью регистрации хемилюминесценции.
Оценить in vitro изменения кислород-зависимого метаболизма интакт-ных полиморфно-ядерных лейкоцитов из крови и перитонеальных макрофагов, и участвующих в динамике воспалительного процесса активированных перитонеальных полиморфно-ядерных лейкоцитов и мононуклеарных фагоцитов под влиянием разных доз препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения.
Исследовать in vivo влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на кислород-зависимые процессы фагоцитов (активированные полиморфно-ядерные лейкоциты - на фоне развития воспаления) при введении экспериментальным животным.
Научная новизна
Проведена оценка влияния препаратов ВВИТ на процессы свободно-радикального окисления: генерацию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в модельных системах in vitro. Впервые показано, что все
исследуемые ВВИТ угнетают ХЛ в модельных системах. ВВИГ способны подавлять образование свободных радикалов. Наиболее выраженное антиокислительное действие препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения проявляется в липидосодержащих модельных системах с высоким содержанием липидов низкой и очень низкой плотности.
Изучено воздействие препаратов ВВИГ на функционально - метаболическую активность фагоцитарных клеток разных видов и генерацию ими АФК при взаимодействии с различными стимуляторами - объектами фагоцитоза. Установлено, что препараты ВВИГ в низких концентрациях способны оказывать стимулирующее действие на функциональную активность фагоцитов, в неодинаковой степени выраженное для препаратов с разными технологиями производства по отношению к тем или иным объектам фагоцитоза.
Впервые установлено, что препараты ВВИГ в высоких концентрациях способны оказывать прямое ингибирующее действие на функционально-метаболическую активность полиморфно-ядерных и мононуклеарных фагоцитов - угнетать активацию процессов кислород-зависимого метаболизма этих клеток, генерацию ими АФК, выявляемую с помощью ХЛ.
Воздействие ВВИГ на инактные полиморфно-ядерные лейкоциты крови и активированные полиморфно-ядерные лейкоциты из очага воспаления.носит дозозависимый модулирующий разнонаправленный характер: низкие концентрации стимулируют генерацию АФК, высокие подавляют. Воздействие ВВИГ на интактные макрофаги и активированные мононуклеарные фагоциты крыс из очага воспаления характеризуются однонаправленными изменениями, осуществляется подавление генерации АФК.
Впервые проведено исследование влияния ВВИГ на процессы кислород-зависимого метаболизма фагоцитов и генерацию АФК (полиморфно-ядерные лейкоциты) in vivo. Установлено, что изменения активности кислород-зависимого метаболизма полиморфно-ядерных лейкоцитов крыс из очага воспаления после введения животным ВВИГ in vivo соответствуют таковым при
10 воздействии препаратов на клетки in vitro и характеризуются дозозависимой
разнонаправленностью: низкие концентрации ВВИТ стимулируют генерацию
АФК клетками, а высокие - подавляют.
В результате проведенных исследований разработаны тест-системы, основанные на измерении хемилюминесценции, позволяющие оценивать влияние ВВИТ на функционально-метаболическую активность фагоцитирующих клеток и генерацию ими АФК.
Научно-практическая значимость работы
Полученные результаты исследования расширяют представление о влиянии препаратов ВВИТ на фагоцитарные механизмы иммунной защиты и процессы образования свободных радикалов — генерацию активных форм кислорода и реакции перекисного окисления липидов.
Выявленные в работе свойства ВВИТ непосредственно взаимодействовать со свободными радикалами, и разнонаправлено изменять функционально-метаболическую активность фагоцитов и сопутствующую ей генерацию актив-пых форм кислорода, являются одним из механизмов модулирующего и противовоспалительного действия препаратов. Результаты, полученные с помощью регистрации хемилюминесценции, дают возможность рекомендовать разработанные методы для определения биологических свойств препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения и доклинической сравнительной оценки их эффективности in vitro. По материалам диссертации получены два патента Российской Федерации на изобретение.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в практическую деятельность лаборатории препаратов крови филиала Иммунопрепарат ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Уфа и Центральной научно-исследовательской лаборатории Башкирского государственного медицинского университета.
Материалы диссертации используются в учебном процессе на лекциях и занятиях на кафедре морфологии и физиологии человека и животных биологи-
' 11
ческого факультета Башкирского государственного университета и кафедре нормальной физиологии Башкирского государственного медицинского университета.
Основные положения, выносимые на защиту
Препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения в модельных системах подавляют процессы перекисного окисления липидов и генерации активных форм кислорода, определяемых с помощью регистрации хеми-люминесценции.
Препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения оказывают стимулирующее воздействие на функционально-метаболическую активность (поглотительную способность, кислород-зависимый метаболизм) интактных полиморфно-ядерных лейкоцитов крови и активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов воспалительного экссудата по отношению к разным объектам фагоцитоза и на интенсивность генерации ими активных форм кислорода, определяемых с помощью регистрации хемилюминесценции, в которой четко отражается степень выраженности такого влияния.
Воздействие препаратов иммуноглобулинов in vitro на генерацию активных форм кислорода интактными и активированными полиморфно-ядерными лейкоцитами из крови и перитонеального экссудата характеризуется дозозависимыми разнонаправленными изменениями их кислород-зависимой активности: низкие концентрации иммуноглобулинов ее стимулируют, а высокие — подавляют. Влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на генерацию интактными и активированными перитонеальными мо-нонуклеарными фагоцитами из экссудата характеризуется однонаправленным характером: как низкие, так и высокие дозы препаратов угнетают процессы кислород-зависимого метаболизма.
Введение экспериментальным животным препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения («Иммуновенин») в разных дозах оказывает разнонаправленное воздействие на функционально-метаболическую активность
12 и генерацию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами из
очага воспаления, аналогичное воздействию препаратов на фагоциты in vitro.
Материалы исследований представлены на ряде научных форумов: I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2006); научно-практической конференции с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2006, 2007, 2008), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Озон в биологии и медицине» (Нижний Новгород, 2007), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008).
Апробация диссертации проведена на расширенном заседании научно-технического совета центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» (протокол от 28.10.2008 г. № 18); на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 (протокол от 24.11.2008 г. № 2).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 116 страницах. Она состоит из введения, обзора литературы (4 главы), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа содержит 14 таблиц, 23 рисунка и 2 схемы. Список литературы включает 214 источников (106 отечественных и 108 зарубежных).
