Содержание к диссертации
Список сокращений 4
Введение 6
Глава 1. Обзор литературы
Характеристика иммуномодулирующего действия Кодивака 11
Иммуномодуляторы и области их применения 16
1.3. Фермент 5'-нуклеотидаза и его роль в организме при различных
физиологически состояниях 25
1.3.1. Локализация и активность 5'-нуклеотидазы в различных тканях
организма человека и животных в норме 26
Исследование активности 5'-нуклеотидазы при различной патологии 30
Изменение активности 5'-нуклеотидазы при экзогенных воздействиях 32
1.4. Облучение и радиорезистентность 37
Действие облучения на макроорганизм 37
Способы повышения радиорезистентности 40
1.5. Циркадные ритмы иммунной системы и её чувствительность к различным
воздействиям 47
Глава 2. Материалы и методы 54
Собственные исследования
Глава 3. Влияние препарата Кодивак на активность мембранного фермента макрофагов
перитонеального экссудата 5'-нуклеотидазы лабораторных животных 58
3.1. Действие Кодивака на активность фермента экто-5'-нуклеотидазы
экспериментальных животных в разные сроки и при разных способах введения 59
Внутрисуточные колебания показателя уровня активности фермента 5'-нуклеотидазы у интактных и вакцинированных животных в условиях облучения 64
Статистический анализ результатов экспериментов по изучению влияния различных факторов на активность 5'-н МПЭ мышей 67
3.4. Изменение активности 5'-нуклеотидазы у разных линий мышей при разных
условиях облучения 70
Глава 4. Влияние препарата Кодивак на выживаемость животных в условиях облучения.74
Введение Кодивака до облучения животных 74
Изучение терапевтического действия Кодивак на облученных животных 79
4.3. Внутрисуточные изменения чувствительности мышей к облучению и
воздействию Кодивака 81
4.4. Зависимость между уровнем активности 5'-н и чувствительностью мышей к
облучению при введении им Кодивака 85
Глава 5. Воздействие препарата Кодивак на пролиферативнуїо и миграционную
активность стволовых кроветворных клеток 90
5.1. Влияние разных способов введения Кодивака на пролиферативнуїо
активность стволовых кроветворных клеток 90
5.2. Влияние Кодивака на эндогенное колониеобразование 92
5.3. Взаимосвязь между эндогенным колониеобразованием и показателями
активности 5'-нуклеотидазы 95
5.4. Влияние Кодивака на миграционную активность СКК 97
Глава 6. Влияние Кодивака на естественную резистентность мышей 102
6.1.Влияние Кодивака на устойчивость к Klebs. pneumoniae 102
Влияние Кодивака на устойчивость к St. aureus 103
Изучение терапевтических свойств Кодивака 109
Глава 7. Обсуждение результатов 112
В ывод ы 125
Список литературы 126
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ - антиген
АКТГ - адренокортикотропный гормон
АМФ - аденозинмонофосфат
Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
ГЛПС - геморрагическая лихорадка с почечным синдромом
ГМДП - гликомурамилдипептид
ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
ИЛ - интерлейкин
ИМ - иммуномодулятор
ИФА - иммуноферментный анализ
КОЕс - колониеобразующая единица селезёночная
Кон А - конканавалин А
Cd tox+(tox_)-коринебактерии дифтерии токсигенный (нетоксигенный) штамм
ЛПС - липополисахарид
МДП - мурамилдипептид
М-КСФ - макрофагальный колониестимулирующий фактор
МП - миелопид
МПЭ - макрофаги перитонеального экссудата
МФ - макрофаг
ОРЗ - острое респираторное заболевание
ПАФ - полный адыовант Фрейнда
ПСКК - полипотентная стволовая кроветворная клетка
5'-н - 5'-нуклеотидаза
РИД - радиальная иммунодиффузия
РПГА - реакция пассивной геммагглютинации
СКК - стволовая кроветворная клетка
СМФ - система мононуклеарных фагоцитов
5 ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы
ЦНС - центральная нервная система
Введение к работе
Актуальность проблемы
Создание и изучение новых иммуномодулирующих препаратов имеет большое значение для медицины и биологии. Эти вещества позволяют разрабатывать пути направленной регуляции иммунных процессов, что необходимо для лечения и профилактики различных заболеваний, в том числе иммунодефнцитных состояний, влияют на физиологические адаптационные возможности организма и поддержание его гомеостаза. Внедрение таких препаратов в практику требует предварительного, всестороннего исследования как биологической активности, так и безвредности входящих в них компонентов и всего комплекса в целом (82, 83, 102). Особый интерес представляют природные ИМ из микроорганизмов, с антигенами (АГ) которых у человека сложились эволюционно закрепленные симбиозом отношения. К таким препаратам относится бактериальный препарат Кодивак, представляющий собой клеточные стенки нетоксигенных коринебактерій! дифтерии (85, 139). Экспериментальное изучение специфической и неспецифической активности этого препарата позволяет использовать его в качестве ИМ для биокоррекции.
Изучение специфической фармакологической активности ИМ проводится в экспериментальных системах, качественно и количественно характеризующих действие испытуемых препаратов на основные звенья иммунитета, функционирование которых обеспечивает развитие реакций клеточного и гуморального типов, а также на стволовые кроветворные клетки (СКК) (82, 83, 102). Несмотря на наличие множества традиционных тестов оценки ИМ продолжается поиск и разработка новых способов исследования их активности и точек приложения в системе макроорганизма.
Биологическая активность ИМ реализуется, в частности, через регуляцию функционального состояния клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы, при этом важнейшую роль играют их мембранные структуры. Плазматическая мембрана обладает многими уникальными свойствами: является физическим барьером клетки и, соприкасаясь с окружающей средой, переносит в клетку всю внешнюю информацию. На поверхности мембраны локализованы специфические АГ, рецепторы гормонов и лекарственных веществ, простагландинов и многих других соединений. В плазматической мембране клеток
7 обнаружено большое количество ферментов, причем физиологическое значение многих из
них еще не разгадано. Для изучения ответа на иммуномодулирующие препараты особый
интерес представляют мембраны клеток системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ),
особенно макрофагов (МФ) (6, 19, 44 , 45, 67, 68, 94, 119, 123).
Большое значение для понимания механизма действия ИМ и оценки их активности
имеет изучение эктоферментов цитоплазматической мембраны МФ, в частности 5'-
нуклеотидазы. Обнаружена зависимость между направленностью изменения этого
этимологического показателя и характером иммуномодулирующего действия препаратов
(45,119).
5'- нуклеотидаза (5'-н) - это один из основных ферментов пуринового обмена, который является ключевым звеном, опосредующим влиянріє различных факторов на жизнедеятельность клеток, в том числе клеток иммунной системы (ИС). С недостаточностью некоторых ферментов пуринового катаболизма связаны тяжелые наследственные заболевания и развитие иммунодефицитных состояний (19, 26, 94).
Значение 5'-н во многом определяется тем, что под ее воздействием идет образование и транспорт аденозина, вносящего существенный вклад в физиологическую регуляцию иммунологических процессов. 5'-н служит регулятором уровня цАМФ, который является внутриклеточным посредником действия гормонов, оказывает влияние на ингибирование костномозговых супрессоров и радиорезистентность животных (19, 26, 94). Получены данные о том, что этот энзим является показателем уровня естественной резистентности животных (24, 39, 40, 45, 111, 118). Было показано изменение активности 5'-н под влиянием ионизирующего облучения (93, 94, 95, 96, 98, 108,109, 121).
Большинство ИМ оказывает стимулирующее воздействие на гемопоэз, что проявляется в увеличении постлучевой выживаемости животных, стимуляции пролиферации СКК и клеток-предшественников, мобилизации КОЕс в периферическую кровь (102, 103, 104). Многочисленные данные литературы убедительно свидетельствуют о том, что и большинство вакцин обладает радиозащитным действием (32, 49, 52, 53, 65, 101, 102, 103, 104).
В поддержании иммунологического гомеостаза важнейшую роль играют полипотентные стволовые кроветворные клетки (ПСКК) костного мозга. При патологических состояниях и при воздействии различных препаратов, в том числе
8 иммуномодулирующих, в них возникают изменения, которые необходимо учитывать
исследователям. Это позволит разработать оптимальную стратегию применения
лекарственных средств, имеющих минимальный повреждающий эффект на систему
гемопоэза, для повышения радиорезистентности и коррекции пострадиационных и
онкологических поражений, а также стимуляции регенерации лимфогемопоэза после
лучевой и иммунодепрессивной терапии (102, 103, 104).
Функциональное состояние и реакции ИС зависят от структуры ее суточной временной организации, являющейся составной частью общей циркадной программы организма (122, 123). С суточными колебаниями функционального состояния связаны колебания активности факторов неспецифической иммунологической резистентности. Обнаружен суточный ритм митотической активности в костном мозге, содержания там ПСКК, колебания содержания гормонов в крови и внутриклеточного содержания ферментов, в том числе аденилатциклазы (и, следовательно, цАМФ) и 5'-н. Существует суточный ритм пролиферации и синтеза ДНК, а также циркадные варианты чувствительности организма к общему излучению и большому числу химиотерапевтических препаратов. То есть реакция ИС оказывается различной в зависимости от циркадной фазы, в которой применяется воздействие (7, 38, 41, 113, 114, 115, 116, 117, 134, 142, 167, 173, 179, 187, 188, 208, 219).
Изучение механизмов регуляции иммунологического гомеостаза необходимо проводить с учетом суточной периодики функционирования ИС в целом. Это позволит повысить качество опытов и может открыть новые подходы к изучаемой проблеме. Определение времени наивысшей чувствительности к иммуноактивным препаратам даст возможность усилить эффективность терапии, снизить дозу препаратов, устранить или ослабить побочные эффекты.
Цель работы:
изучение особенностей иммуномодулирующего действия препарата Кодивак по его влиянию на функциональную активность макрофагов перитонеального экссудата и стволовых кроветворных клеток животных, устойчивость их к облучению, а также зависимости этих характеристик от времени суток. Задачи:
1. Охарактеризовать влияние Кодивака на активность мембранного фермента МПЭ 5'-нуклеотидазу мышей различных линий и морских свинок.
2. Изучить влияние Кодивака на формирование устойчивости мышей к бактериальным
инфекциям.
Исследовать радиопротективные свойства Кодивака, характер его воздействия на СКК мышей.
Проследить зависимость активности мембранного фермента МПЭ 5'-нуклеотидазы и пострадиационной гибели животных от внутрисуточного времени воздействия.
Научная новизна работы
Разработан модифицированный микрометод «Первичного отбора иммуномодуляторов по уровню активности5'-н макрофагов перитонеального экссудата мышей».
Показаны иммуномодулирующие свойства препарата Кодивак по методу «Первичного отбора иммуномодуляторов по уровню активности 5'-н макрофагов перитонеального экссудата мышей».
Установлено, что активность 5'-н у интактных и вакцинированных Кодиваком мышей Fi(CBAxC57Bl/6) имеет колебания в течение суток.
Обнаружен радиопротективный эффект Кодивака и зависимость его от интервала времени между введением препарата и облучением животных.
Выявлены периоды времени в течение суток наибольшей и наименьшей чувствительности организма мышей к экзогенным воздействиям (введению препарата и облучению).
Показано наличие корреляционных связей между количественными показателями функциональной активности различных иммунокомпетентных клеток.
Установлено, что Кодивак формирует резистентность мышей к инфекциям, вызываемым Klebs. pneumoniae и St. aureus, и способствует заживлению некротических поражений кожи при стафилококковой инфекции.
Практическая ценность работы
Написаны методические рекомендации по способу «Первичного отбора иммуномодуляторов по уровню активности 5'-н макрофагов перитонеального экссудата мышей».
Препарат Кодивак может быть рекомендован для комплексного использования при лучевой терапии.
10 Особенности внутрисуточной реактивности макроорганизма должны учитываться при
использовании препарата Кодивак в лечебных и профилактических целях.
