Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биологическая активность, физико-химические свойства акридонуксусной кислоты, янтарной кислоты и N-метилппокамина. Лекарственные формы на их основе 16
1.1.Синтез, физико-химические свойства и фармакологическая активность N-метилглюкамина 16
1.2.Фармакологические свойства, механизм противови русного действия акридонуксусной кислоты 21
1.3 .Роль янтарной кислоты при состояниях, сопровождающихся нарушением свободнорадикального гомеостаза 33
1.3.1.Реализация основных фармакологических свойств янтарной кислоты в лекарственных препаратах 46
Глава 2. Материал и методы 50
Глава 3. Синтез и физико-химические свойства циклоферона (метилглюкамина акридонацетата)
92
Глава 4. Фармакологическая активность и механизм действия циклоферона 105
4.1..Интерферониндуцирующая и противовирусная активность циклоферона на моделях вирусных инфекций 111
4.2. Антиканцерогенная активность циклоферона и его эффективность в качестве средства экспериментальной лучевой терапии опухолей 129
4.3 .Влияние циклоферона на репарацию тканей 142
4.4.Изучение иммунотропных свойств циклоферона (метилглюкамина акрид онацетат) 149
4.4.1. Воздействие циклоферона на экспрессию цитокинов в клетке 151
4.4.2.Индукция м-РНК цитокинов в клетках, под воздей ствием циклоферона 155
Глава 5. Комплексные субстратные антигипоксанты/ антиоксиданты на основе метилглюкаммония сукцината
5.1.Синтез и антигипоксическая активность Na,N-метилглюкаммония сукцината 171
5.2. Фармакологическая активность комбинированных субстратных соединений на основе Na,N- метилглюкаммония сукцината 182
5.3.Изучение фармакокинетики цитофлавина, раствора для внутривенного введения 206
5.4.Влияние комбинированного субстратного антиокси- данта (цитофлавина) на противовирусную (интерферо- ниндуцирующую) активность цикло ферона 218
Заключение 227
Выводы 261
Список литературы
- .Роль янтарной кислоты при состояниях, сопровождающихся нарушением свободнорадикального гомеостаза
- Антиканцерогенная активность циклоферона и его эффективность в качестве средства экспериментальной лучевой терапии опухолей
- Воздействие циклоферона на экспрессию цитокинов в клетке
- Фармакологическая активность комбинированных субстратных соединений на основе Na,N- метилглюкаммония сукцината
Введение к работе
В настоящее время поиск и разработка новых лекарственных препаратов относится к числу наиболее сложных и практически неотделимы от таких дисциплин, как химия, биология, физика и многих других смежных отраслей науки.
Тесное взаимодействие химика и фармаколога в поиске новых биологически активных соединений позволяет быстро проводить эффективную оценку вновь синтезированного химического соединения и полностью оценить весь спектр его потенциальной фармакологической активности. Знание структурно-химических корреляций биологической активности позволяет сузить поиск соединений среди изучаемого класса и организовать расширенное фармакологическое изучение наиболее перспективных веществ.
Поскольку соотношение «структура - биологическая активность» верны только в пределах одного ряда химических соединений, то для прогнозирования потенциальной фармакологической активности соединения необходима адекватная оценка биологических эффектов ранее синтезированных структур данного класса.
В настоящее время особое место в современной медицинской химии и фармакологии занимает биоскрининг, охватывающий ежегодно огромное число как индивидуальные химические соединения, так и многокомпонентные природные, животные и растительные экстракты. И хотя из 10000 изучаемых химических соединений лишь одно, в дальнейшем, проходит полный цикл медико-биологического изучения, б качестве потенциального лекарственного препарата, значение первичных скрининговых исследований трудно переоценить.
Особое значение для создания нового лекарственного препарата в совместной работе химика и фармаколога, после первичного скрининга ряда биологически активных веществ, отводится отбору из спектра изученных соединений наиболее перспективного образца.
В исследованиях по разработке нового лекарственного препарата особое значение имеет адекватная последующая оценка химической стабильности, безопасности и фармакологической активности выбранного соединения.
Однако, выделенные в ходе первичного скрининга новые активные образцы соединений наряду с высокой биологической активностью, зачастую обладают целым комплексом отрицательных свойств - так высокая токсичность соединения обусловлена химической, термической или фотонестабильностью, а из плохой растворимости обычно следует низкая биодоступность вещества.
Следовательно, одним из перспективных направлений научных исследований, по созданию новых лекарственных препаратов, является модификация биологически активных соединений, проводимая для придания ранее синтезированному биологически активному соединению новых фармакологических свойств.
Одним из наиболее совершенных инструментов для придания выбранному биологически активному соединению необходимых фармакологических свойств, является химический синтез, приводящий к получению абсолютно новой химической структуры, зачастую и с абсолютно новыми фармакологическими свойствами. Альтернативным путем улучшения фармакологических свойств выбранного соединения является создание комплексного препарата (комбинации) вновь синтезированного продукта с уже известными биологически активными соединениями, что требует детальных исследований по химической и фармакологической совместимости компонентов.
Научные знания, полученные в результате исследований новых биологически активных соединений, комплексных лекарственных препаратов, расширяют представления о воздействии химической структуры на живой организм и стимулируют научный поиск новых, более эффективных биологически активных молекул [181].
Настоящую работу следует отнести к актуальным исследованиям, поскольку она включает:
развернутую оценку нового класса фармакологически активных соединений;
направленный синтез новых лекарственных средств из исследуемого ряда соединений;
исследования фармакологической активности полученных лекарственных препаратов;
изучение механизмов действия полученных лекарственных препаратов и связь химического состава с проявляемыми биологическими эффектами;
получение новых данных о корреляции биологических эффектов, полученных «in vitro» с эффектом на организм человека «in vivo».
Работа выполнена в соответствии с федеральными программами «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского направления» [Постановление Правительства РФ №1414 от 23.11.1996г.] и «Медицина высоких технологий» [Постановление Правительства Российской Федерации от 25 ноября 1998 т. № 1391], а также в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН по направлениям «Создание новых лекарственных средств методами химического и биологического синтеза», «Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении».
Проведенные исследования позволяют сделать обоснованные выводы о перспективности полученных производных на основе N-метилглюкамина.
В связи с вышесказанным, целью настоящей работы является разработка оригинальных лекарственных препаратов, в состав которых входят биологически активные органические кислоты, с применением современных переносчиков лекарственных веществ основного характера с оценкой их безопасности и изучением фармакологической активности.
Исходя из цели исследования, были поставлены следующие задачи:
Синтезировать безопасное фармакологически приемлемое соединение на основе акридонуксусной кислоты с применением современных соле- и комплексообразователей, обладающее интерферониндуцирую-щей активностью в отношении цитокинов (сс-интерферона и других).
Синтезировать новую транспортную форму янтарной кислоты, в виде сложного сукцината с созданием на ее основе безопасных лекарственных препаратов с высокой фармакологической активностью, обладающих выраженными детоксицирующими свойствами;
Оценить безопасность с изучением фармакологической активности разработанных (на основе сложных субстратных композиций) оригинальных лекарственных препаратов in vitro и in vivo, с целью последующего проведения клинических испытаний и внедрения их в медицинскую практику.
Научная новизна работы
Впервые показано, что соли и комплексы N-метилглюкамина с органическими кислотами представляют собой класс биологически активных веществ, перспективных для разработки эффективных лекарственных препаратов, обладающих высокой биологической доступностью.
На основе N-метилглюкамина и АУК синтезирован высокоактивный низкомолекулярный индуктор интерферона - циклоферон
На экспериментальных моделях in vitro, in vivo изучены противовирусный, противоопухолевый (антипромоторный, антиканцерогенный), им-муномодулирующий эффекты циклоферона, установлен механизм дейст-
вия препарата.
Впервые целенаправленно синтезирована фармакологически активная смешанная Ка,М-метилглюкамониевая соль янтарной кислоты -реам-берин.
На экспериментальных моделях in vitro и in vivo показана его безопасность, установлены детоксицирующие свойства, в основе котороых лежат антигипоксический и антиоксидантный механизмы.
На основе реамберина разработаны сложные метаболические (субстратные) композиции:
Цитофлавин - метаболический церебропротектор;
Ремаксол - инфузионный гепатопротектор;
Реоплазмин - плазмозамещающий раствор комбинированного действия;
Осмофузин - осмотический диуретик;
На экспериментальных моделях изучена их безопасность, оценены фармакологические свойства, охарактеризован механизм действия разработанных лекарственных препаратов, потенциально определено их последующее медицинское применение.
Практическая ценность работы
Разработаны и утверждены в МЗ РФ нормативно-методические документы: промышленный регламенты и фармакопейные статьи предприятия:
Циклоферон 12,5% раствор для инъекций (ПР 64-23057866-016-03; ФСП42- 0320170001); Реамберин 1,5% раствор для инфузий (ПР 64-23057866-013-02; ФСП-420320158401); Цитофлавин, раствор для внутривенного введения (ПР 64-23057866-017-03; ФСП- 42-0320339802).
Зарегистрированы в Российской Федерации препараты на основе N-метилглюкамина:
Циклоферон 12.5% для инъекций (рег.№ 95/211/5, перерегистрация в связи с введением новых требований, Р№ 001049/03-2002);
Реамберин 1.5% для инфузий (рег.№ 99/363/2 ; перерегистрация в связи с новыми требованиями 001048/01-2002);
Цитофлавин раствор для внутривенного введения (Р№ 003135/01-2004).
Проведенные исследования послужили основой для организации промышленного выпуска оригинальных лекарственных препаратов: Циклоферон 12.5% раствор для инъекций; Реамберин 1.5% раствор для инфузий; Цитоф лавин раствор для внутривенного введения.
Разработаны и представлены на утверждение в Министерство промышленности, науки и технологий необходимые нормативно-методические документы для получения лицензии (№64/0139-Л/03 от 16 января 2003г.) на производство разработанных нами оригинальных лекарственных препаратов (реамберин, раствор для инфузий 1.5%; циклоферон раствор для инъекций 12.5%; цитофлавин, раствор для внутривенного введения), в связи с окончанием проведения клинических исследований и получением разрешения на их медицинское применение.
Представлены в Федеральную службу по надзору в сфере здравоохранения для проведения рандомизированных контролируемых клинических исследований, с последующей регистрацией оригинальные препараты «ремаксол», «реоплазмин» и «осмофузин».
На основе проведенных исследований подготовлено пособие для врачей «Особенности течения гемоконтактных вирусных гепатитов в зависимости от состояния внешней среды». (Ученый Совет МЗ РФ, протокол №8, от 01.12.03.)
Утверждены УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России учебные пособия «Иммуномодуляторы с противови-
11 русной активностью» (протокол №1 от 16.02.04г., УМО-639 от 22.10.2004г.); «Применение иммуномодуляторов в хирургической клинике» (УМО-128 от 27.08.2004.); «Оценка качества жизни у больных инфекционного стационара» (УМО-640 от 22.10.2004).
Постановлением Правительства Российской Федерации № 85 от 16.02.04г. « За разработку технологии, организацию промышленного выпуска и внедрение в медицинскую практику готовых лекарственных форм нового отечественного препарата циклоферон» присуэюдена премия Правительства Российской Федерации в области науки и техники 2003г.
Утверждены два информационных письма для врачей:
«Применение реамберина при острых экзогенных и эндогенных интоксикациях» ( утверждено заместителем руководителя Департамента здравоохранения г.Москвы Лешкевич И.А., председателем УМС Департамента здравоохранения г.Москвы Костомаровой Л.Г.).
«Оптимизация профилактики и лечения острых респираторных заболеваний», информационное письмо для терапевтов, инфекционистов, педиатров (утверждено председателем комитета здравоохранения администрации г.Саратова Михайловым А.В.).
Положения, выносимые на защиту
1. N-метилглюкамин является не только солеобразователем, но и обладает высокой фармакологической активностью. Фармакологические эффекты МГА обусловлены наличием большого количества гидроксильных групп, образующих водородные связи, что приводит к формированию стойких комплексов аминоспирта с белками клеточных мембран несоответственно, изменению заряда и гиперполяризации мембран, влияя на калий/натриевый насос. Кроме того, МГА конкурентно взаимодействует с анионами и, следовательно, способствует их селективному переносу через биологические мембраны.
На основе N-метилглюкамина и акридонуксусной кислоты разработан лекарственный препарат — циклоферон, обладающий интерферонин-дуцирующей активностью в отношении цитокинов, характеразующиися противовирусной, противоопухолевой, (антипромоторное, антиканцерогенное действие) и иммуномодулирующей активностью.
Противовирусный эффект соединения реализуется на уровне репликации вируса, на стадии внутриядерной сборки вирусных капсидов, на поздних стадиях репликативного цикла, за счет увеличения количества ДИ-частиц и снижения вирус-индуцированного синтеза белка в клетке, опосредованного экспрессией специфического ядерного рецептора и/или эффекторного белка.
4'. Под влиянием циклоферона индуцируется каскад сигналов, включающих «цитокиновую сеть». Цитокинкорригирующее действие связано с активацией генов интерферона, IL-4, IL-12, а также подавлением экспрессии генов TNF-ct и IL-6.
5. Синтезирована новая фармакологически активная смешанная ШД-метилглюкаммониевая соль янтарной кислоты - реамберин, обладающий антигипоксическим, антиоксидантным действием. На его основе показана возможность создания субстратных композиций разнонаправленного действия (ремаксол, реоплазмин, осмофузин, цитофлавин), обладающих антиоксидантной/антигипоксантной активностями.
Апробация и внедрение результатов исследования
Основные результаты исследования доложены и обсуждены на:
3, 4, 5, 6-м Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996,1997; 1998; 1999);
32-ой научно-практической конференции дерматовенерологов, акушер-гинекологов и урологов С-Петербурга (Санкт-Петербург, 18-20 июня 1997 г.);
Юбилейной международной научной конференции "Грипп - XXI век"
(Санкт-Петербург, 28 сентября- 2 октября 1997 г.); Второй Всероссийской научной конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 19-21 мая 1998 г.);
Научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (Пенза, 20-24 апреля 1998 г,);
На третьем пленуме правления ассоциации ортопедов-травматологов России (Уфа, 1998г.);
Зональной научно-практической конференции травматологов и ортопедов Северо-Запада России (Великий Новгород, 1998 г); Международной конференции «Фармация в 21 веке: инновации и традиции» (Санкт-Петербург, 8 апреля 1999 г.);
Международной конференции «Конструктивная и деструктивная гипоксия» (Украина, Киев 12-14 июня 1998 г.);
Научной конференции посвященной 200-летию ВМедА "Современные проблемы герпесвирусной инфекции" (Санкт-Петербург, 17 фев 1999г.); Конгрессе педиатров России (Москва 16-18 февраля 1999 г.); Научной конференции «Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней (Санкт-Петербург 27-28 октября 1999 г.); Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Санкт-Петербург, 1999 г); Международной конференции «Фармация в XXI веке»: инновации и традиции (Санкт-ПетербургД999 г);
Научно-практической конференции «Безопасность и здоровье подростков» (Санкт-Петербург, 1999г.);
Научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины» (Санкт-Петербург, 18-20 дек. 2000 г.);
Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2002г.);
Рабочем совещании РАМН «Митохондрии в патологаи» (Москва, 2001г.);
Научно-практической конференции врачей Приволжско-Уральского Военного округа «Актуальные вопросы военной и практической медицины» (Оренбург, 2003 г);
Международной конференции «Успехи современного естествознания: гомеостаз и инфекционный процесс» (Дагомыс, 2002; 2003г.);
12-м и 13-м международных конференциях молодых ученых Санкт-Петербургского государственного университета «Человек. Природа. Общество. Актуальные проблемы». (Санкт-Петербург; 26-30 дек 2001, 2002 г);
6-м Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 29-31 окт. 2003 г.);
Юбилейной конференции, посвященной 60-ти летию Пензенского государственного университета (19-21 ноября 2003г.);
Научно-практической конференции «Актуальные проблемы офтальмологии», (Москва, 2003 г);
Заседании Ученого Совета ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН (Москва; 20 марта 2003г);
Расширенном заседании Ученого Совета ГУ НИИ вирусных препаратов РАМН (Москва) 30 октября 2003г.; на совете по присуждению премий Правительства РФ в области науки и техники 19 декабря 2003г., в рамках выполненной программы «Разработка технологии, организация промышленного выпуска и внедрение в медицинскую практику готовых лекарственных форм циклоферона».
Научно-практической конференции «Выпускник фармацевтического вуза: вчера, сегодня, завтра» - Санкт-Петербург.-2004 г);
3-й и 4-й международных конференциях «Клинические исследования лекарственных средств в России» (Москва, 2003; 2004 гт);
4-ой международной конференции РУДН «Здоровье и образование в
XXI веке», Москва.-21-22 октября 2004г. 60-региональной конференции Пятигорской химико-фармацевтической академии (Пятигорск.-29-30 января 2005г.).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов.
Указатель литературы включает 170 отечественных и 262 зарубежных источников.
Работа представлена на 311 страницах машинописного компьютерного текста, иллюстрирована 50 таблицами и 36 рисунками.
По теме диссертационного исследования опубликовано 85 работ в открытой печати, в т.ч. 63 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получено 6 патентов на изобретения.
.Роль янтарной кислоты при состояниях, сопровождающихся нарушением свободнорадикального гомеостаза
Первичное тестирование представленных производных акридона показало, что они не обладают антибактериальной активностью. С другой стороны, все соединения этой группы при исследованиях на клеточных линиях лимфоцитарной лейкемии мышей (Р-388) и промиелоцитарной лейкемии человека (HL-60) обладали значительной цитотоксической активностью. После первичного скрининга производных акридона, были отобраны соединения, проявившие максимальную цитотоксическую активность, которая была сопоставима с активностью этопосида — ингибитора топоизоме-разы II, применяемого в клинической практике в качестве противоопухолевого препарата.
Эти производные оказались активными и в экспериментах на клеточных линиях солидных опухолей человека (LoVo) и грызунов (В 16. LLC, СНО). При сравнительном анализе цитотоксического действия на нормальные и опухолевые ткани были отобраны соединения, обладающие высокой активностью в отношении опухолевых клеток и практически не повреждающие нормальные ткани (соединения 25, 26).
Эти исследования служат примером целенаправленного дизайна противоопухолевых соединений и высокой экспериментальной культуры при создании высокоэффективных и безопасных терапевтических агентов. Высокий уровень индуцируемого а/р-интерферона, продуцируемого натриевой солью АУК, оказывает тормозящее действие на развитие различных опухолей у мышей. При этом антипролиферативный эффект индуктора интерферона был более выражен на модели перевиваемой слабо мета-стазирующей опухоли лимфосаркомы, по сравнению с моделью быстро ме-тастазирующей опухоли [55, 57, 152, 225].
При предварительном введении животным Corynebacterium parvum с последующей индукцией солью АУК противоопухолевый эффект препарата значительно увеличивался. Характерно, что введение в параллельном опыте природного индуктора интерферона - вируса Ньюкасла, вместо соли АУК, не приводило к усилению противоопухолевого эффекта на модели лимфомы мышей, что говорит о различных биологических эффектах ин-терферонов, синтезирующихся в ответ на воздействие "химического" и "биологического" индуктора [376, 377, 379].
В ходе изучения действия натриевой соли АУК на гормонозависимые опухоли показано, что препарат модифицирует экспрессию стероидных гормонов в гормонозависимых опухолях [266] и потенцирует действие на опухоль антиэстрогенных лекарственных средств [58, 152]. Наибольший противоопухолевый эффект АУК на моделях перевиваемых опухолей — карциномы Эрлиха, лимфосаркомы Плисса и лейкоза L1210 у мышей наблюдали при комбинации индуктора интерферона с цитостатиком цикло-фосфаном. Очевидно, что усиление противоопухолевого действия цикло-фосфана связано с иммуномодулирующим действием интерферона. Однако выраженность противоопухолевого эффекта комбинации колебалась в зависимости от типа опухоли, вида и линии животных, дозы, режима и курса введения АУК. Так, предварительное введение цитостатика винкристина полностью подавляло синтез интерферона у мышей [55, 56, 60, 61].
Учитывая, что фармакологические эффекты АУК выходят за рамки, которые можно объяснить только индукцией интерферона, очевидно, что противовирусное, противоопухолевое и антипролиферативное действие АУК может быть связано не только с эффектами индуцируемого интерферона, но и с дозозависимым специфическим ингибированием ключевого внутриклеточного фермента цикл о-АМФ-фосфодиэстеразы, Ингибирование фосфодиэстеразы приводит к снижению содержания в клетке универсального месенжера цикло-АМФ, повышая чувствительность клетки к антигенному и митогенному воздействию [347, 348].
Помимо эффектов, связанных с индукцией интерферона, возможно "непосредственное" противовирусное и противоопухолевое действие АУК, опосредованое через ингибирование функций ключевых ферментов дыхательной цепи митохондрий клетки - убихинонов, либо ингибированием связывания АТФ с митохондриальным АДФ/АТФ-зависимым транспортным белком, путем специфического ковалентного присоединения АУК по пептидной связи лизин-цистеин , а также дозозависимой активацией NK-клеток [167,168,169,310,311].
Дальнейшие исследования взаимодействия АУК с альбуминами выявило, что соединение весьма слабо связывается с белками крови, а взаимодействие с мембранными белками эритроцитов приводило к некоторому усилению стабильности мембран эритроцитов к действию гипотонических растворов. Данный факт свидетельствует о возможности специфического связывания АУК с мембранными белками и "рецепторного" механизма индукции интерферона. "Рецепторную" теорию индукции интерферона подтверждают факты об инициации эстрогеновых и прогестиновых рецепторов клетки под воздействием АУК [58,152, 336].
Исследование мутагенности и генототоксичности показало, что АУК не обладает данными свойствами и не интеркопирует в ДНК несмотря на малый размер, плоскую гетероароматическую структуру и отрицательный заряд [152, 342, 349].
Проведенные нами исследования механизма действия АУК показали, что она (в 29 - 44 раза) стимулирует транскрипцию генов а-интерферона и влияет на экспрессию генов IL-2, IL-4, IL-8, у-интерферона и TNF, что по 33 зволяет предположить наличие в клетках специфического рецептора, с которым связывается соединение [59,71].
Антиканцерогенная активность циклоферона и его эффективность в качестве средства экспериментальной лучевой терапии опухолей
Экспериментальное изучение индукции различных опухолей у человека и животных показали, что развитие большинства из них является много стадийным процессом, который может быть условно разделен на три стадии: инициацию, промоцию и прогрессию опухоли. Первые две стадии отражают процесс канцерогенеза, прогрессия показывает процесс дальнейшей эволюции опухоли. В настоящее время существенно расширились представления о клеточных взаимодействиях в различных тканях. В частности, промоторная и антипромоторная активности, все чаще рассматривается в контексте механизмов рекапитуляции эмбриогенеза. Явление дезорганизации ткани рассматривается уже не как нарушение механических связей между клетками, а как информационный дефицит цитокиновых межклеточных каналов [420].
В клетке, лишенной информации от своих «соседей», блокируются очень многие генетические программы, определяющие ее специфичность, и активируются программы пролиферации. Если при этом нарушены механизмы апоптоза и\или снижен иммунитет, процесс пролиферации приобретает злокачественный характер.
Учитывая, что в настоящее время имеются данные по антипромотор-ному и антиканцерогенному действию интерефрона, необходимым является изучение потенциальной антипромоторной активности циклоферона, а с учетом, того, что интерферон и другие иммуномодуляторы могут тормозить опухолевый рост, представляло несомненный интерес изучить влияние циклоферона на возникновение и развитие новообразований. Для оценки потенциального антиканцерогенного действия препарата было необходимо проведение экспериментальных исследований на моделях химического канцерогенеза легких мышей, вызванных введением метилхолантрена и уретана, а также оценить канцерогенез кишечника у крыс, вызванный 1,2 диметилгидразином [176], поскольку возникающие опухоли по своей морфологии сходны с аналогичными новообразованиями у человека.
Многообразие известных к настоящему времени физиологических функций интерферонов, несомненно, указывает на их контрольно-регуляторную роль в сохранении нуклеинового гомеостаза организма [373, 397, 402, 406]. Клинические исследования эффективности рекомбинантных и природных препаратов интерферонов нескольких типов свидетельствуют о том, что их введение оказывало положительный эффект при некоторых видах опухолей. Различные степени регрессии новообразований при применении интерферонов наблюдали при волосато-клеточном лейкозе, эссен-циальной тромбоцитопении и хроническом миелолейкозе [48-52, 182, 183, 382,420],
Эффективность курса введения интерферонов наблюдалась при карциноме молочной железы злокачественной миеломе, остром лейкозе, ме-ланоме, саркоме Капоши, карциноме мочевого пузыря, злокачественной глиоме, назофарингеальной карциноме, колоректальном раке. Отмечалось уменьшение размеров опухоли, стабилизация ее размеров, ремиссия, увеличение выживаемости. Часто наблюдалась зависимость противоопухолевого действия препаратов интерферонов от их дозы введения. Положительный эффект применения интерферонов в онкологии отмечался в комбинации с цитостатическими средствами, ретиноидами, антиэстрогенами при гормо-нозависимых опухолях, в связи с чем, представлялось целесообразным изучение противоопухолевой активности циклоферона на экспериментальных моделях, в соответствии с методами испытания химиопрепаратов на моделях экспериментальных опухолей [251,252].
В настоящее время получены данные [60, 104, 207] о радиозащитном действии интерферонов и их индукторов при воздействии у-излучения на организм. Эффект интерферонов при радиационном воздействии, реализуется по тому же механизму, что и антимутагенное действие (блокирование индукции хромосомных аббераций и иммунодепре сии организма под действием излучения).
С целью повышения эффективности лечения злокачественных новообразований, перспективно применение интерферонов в комбинации с лучевой терапией опухолей [226, 235, 308].
Учитывая высокие титры интерферона, продуцируемые под воздействием циклоферона и способность преодолевать гематоэнцефалический барьер, целесообразно оценить биологическую активность препарата при моделировании терапии опухоли головного мозга.
Лучевая терапия приводит к существенному снижению числа лейкоцитов, то в качестве препарата для сравнения, стимулирующего пострадиационное восстановление миелопоэза, был применен рекомбинантный коло-нестимулирующий фактор лейкомакс (молграстим).
Представляем результаты изучения биологической активности циклоферона при моделировании терапии опухоли головного мозга. Корреляционный анализ полученных данных показал, что гибель крыс в группах была связана с размером опухолей (г 0,764). Вместе с тем, размер опухоли был связан с числом циркулирующих гранулоцитов на 14 день после облучения (г = 0,492.). На терминальном этапе объем опухоли имел взаимосвязь с числом циркулирующих моноцитов (г = 0,600) и с концентрацией гемоглобина у облученных животных (г = 0,636).
Введение циклоферона оказывало положительное влияние на изменения этих параметров и прекращение введения препарата на терминальном этапе процесса онкогенеза представляется нецелесообразным в плане повышения эффективности лучевой терапии опухолей. Можно полагать, что следует изменить режим введения препарата, путем удлинения терапевтического курса и/или путем увеличения доз.
Воздействие циклоферона на экспрессию цитокинов в клетке
Полученные результаты свидетельствуют, что стимуляция синтеза интерферона под действием циклоферона происходит на уровне транскрипции соответствующего гена и не обусловлена его влиянием на посттранскрипци онные процессы, такие как повышение скорости трансляции, стабилизация м-РНК интерферона, или комплекса м-РНК-рибосома, а также выбросом ранее синтезированного интерферона. В то же время, нечувствительность генов TNF-a и IL-2 к воздействию циклоферона говорит об избирательности этого препарата по отношению к синтезу разных цитокинов, указывая на приоритетную роль лиганд/рецепторных взаимодействий, в сравнении с влиянием циклоферона непосредственно на ДНК.
Исходя из динамики клеточной локализации препарата, а также данных о резкой активации синтеза РНК при его воздействии (рис. 4.8, табл. 4.19), можно предполагать наличие в клетке специфического белка-переносчика, а на ядерной мембране - рецепторов, опосредующих действие циклоферона и обладающих невысокой аффинностью к этому соединению. Связываясь с такими рецепторами (самостоятельно или в форме комплекса с сывороточным белком), препарат «запускает каскад реакций», приводящих к усилению синтеза интерферона, по аналогии с взаимодействием антиген/рецептор в имму-ноцитах.
В организме сходный эффект можно наблюдать при дифференцировке В-лимфоцитов в плазматические клетки при стимуляции антигеном. В этом случае действие индуктора ограничивается клеточной мембраной, а механизм активации транскрипции генов секретируемых иммуноглобулинов включает вторичные внутриклеточные посредники. Возможно, что, попадая в клетку, циклоферон имитирует один из них, что и приводит к наблюдаемому усилению процессов белкового синтеза в клетках.
Таким образом, воздействие циклоферона на клетки моноцитарного ряда U-937 приводило к резкому нарастанию концентрации тотальной РНК в клетке, достигающей максимальной величины, в 11 раз превышающей контрольную, через б часов воздействия препарата. Резкое повышение уровня тотальной РНК и м-РНК IFN-a, уже через 2 часа, после начала стимуляции позволяет рассматривать индукцию этого гена как первичный ответ клеток U-937 на циклоферон. Индукция интерферона под действием циклоферона происходит на уровне транскрипции соответствующего гена и не обусловлена его влиянием на посттранскрипционные процессы. Нечувствительность генов TNF-a и IL-2 к воздействию циклоферона говорит об избирательности этого препарата по отношению к синтезу разных цитокинов.
Для уточнения этого предположения и были предприняты исследования спектра цитокинов, индуцируемых циклофероном. Линия клеток «неиммунного происхождения» MG-63 остеосаркомы человека, как оказалось, спонтанно продуцирует м-РНК IFN-a и TNF-a (рис. 4.10).
Обработка клеток циклофероном в концентрации 50 мкг/мл в течение 2 часов не влияла на спектр мРНК для цитокинов в линии клеток MG-63 (рис. 4.11): было обнаружено м-РНК для IFN-a и TNF-a, подобно необработанной культуре клеток. Линия клеток миелогенного лейкоза человека К-562 конститутивно продуцировала м-РНК для IL-6 (слабо различимая полоса) и TNF-a (рис. 4.12). Обработка клеток циклофероном в концентрации 50 мкг/мл привела к значительным изменениям спектра продуцируемых м-РНК для цитокинов (рис. 4.13): обнаружено появление м-РНК для IFN-y, IL-1 и IL-2, а также усиление выявляемой полосы, соответствующей IFN-a и интерлейки-ну-6, при полном исчезновении полосы, характеризующей м-РНК для TNF-a.
Таким образом, циклоферон индуцировал в линии клеток К-562 м-РНК для IFN-y и IL-2, и таким образом, может считаться индуктором клеточного иммунитета (ТЫ-тип иммунного ответа).
Однако, кроме этих м-РНК, циклоферон также индуцировал м-РНК провоспалительных цитокинов IL-1 и IL-6 и полностью подавлял синтез м-РНК для TNF-a, что характерно для Тп2-типа иммунного ответа.
Индукция IL-6, и ингибирование TNF-a, характерно для Тп2-типа иммунного ответа, в связи с этим в данной модели циклоферон, являясь интер-фероногеном, проявляет свойства индуктора смешанного Thl и ТЬ2-типа иммунного ответа, что ранее было показано для интерферона на другой модели при энтеральной инфекции мышей вирусом простого герпеса или рео-вирусом.
Фармакологическая активность комбинированных субстратных соединений на основе Na,N-метилглюкаммония сукцината
У реоплазмина установлена «противошоковая активность», что подтверждено на моделях в экспериментах при экзо - и эндотоксикозе в условиях шокового состояния (интоксикация, вызыванная введением солей свинца, экспериментальный геморрагический шок и ожоговая травма). В экспериментальных исследованиях in vivo реоплазмин, по своей фармакологической активности, превосходил препарат сравнения Хаес-стерил.
На моделях черепно-мозговой травмы показано отсутствие летальности у экспериментальных животных, получавших осмофузин. Кроме этого, препарат активно проявлял антиоксидантные и антигипоксантные свойства (нормализовался электролитный обмен, снижался уровень эндотоксикоза, улучшалась микроциркуляция, нормализовались метаболические сдвиги), также было установлено позитивное влияние композиции на психические познавательные процессы экспериментальных животных (обучение, возбуждение, торможение и память).
Субстратная композиция цитофлавин не оказывает токсического действия на культуру клеток; токсичность препарата (ЦТД50) проявляется в дозе 6 и более мг/мл. Цитофлавин (в концентрации от 0.6 до 30 мкг/мл, при 4-х часовой экспозиции и в концентрации, от 3-х до 15 мкг/мл, при 24-х часовой экспозиции), оказывает умеренно выраженный противовирусный эффект, связанный с метаболической стимуляцией, обеспечивая защиту клеток от гибели.
В экспериментальных исследованиях установлено, что цитофлавин обеспечивает антигипоксический эффект, увеличивая резервную антиокислительную активность организма животных, на фоне выраженного проти-воишемического действия препарата, заключающегося в снижении интенсивности процессов перекисного окисления липидов, восстанавления тиол-дисульфидного равновесия в клетке. Антитоксическая функция заключается в нормализации выделительной, экскреторной и секреторной функций почек экспериментальных животных.
Радиозащитный эффект цитофлавина обеспечивается снижением (до 45.0%) летальности и увеличением продолжительности жизни, облученных животных, а гепатопротекторная активность (установленная на модели отравления ядовитыми грибами экспериментальных животных) проявляется в увеличении процента выживших животных (от 55.0 до 75.0) в зависимости от вводимой дозы экстракта ядовитых грибов.
Установлено снижение летальности экспериментальных животных, под воздействием цитофлавина, на модели острого инфаркта миокарда: ци-тофлавин сохранял жизнь 93.0, неотон 70.0% животных, против 48.0% животных контрольной группы. Цитофлавин усиливал скорость репаративного синтеза ДНК в кардиомиоцитах, увеличивая на 20-30% количество клеток с репликативным синтезом ДНК.
Изучена фармакокинетика основных компонентов препарата «Цитофлавин раствор для инъекций» у здоровых добровольцев при внутривенном капельном введении. За 14 дней до госпитализации добровольцы, отобранные согласно критериям включения, были подвергнуты стандартному клиническому и лабораторному обследованию с целью дальнейшего допуска к участию в исследовании. Всего в исследование было включено 24 здоровых добровольца (7 мужчин и 17 женщин), средний возраст которых составил 33,8 ± 10,1 лет, средний рост- 167,3 ± 7,9 см, средний вес - 66,8 + 10,3 кг.
Приблизительно за 20 мин до начала исследования добровольцу устанавливались катетеры в локтевые-вены обеих рук (один для осуществления инфузии, второй - для отбора проб крови). Препарат вводили капельно в виде раствора 20 мл цтофлавина в 50 мл изотонического раствора. Длительность введения колебалась в зависимости от переносимости препарата от 10 до 18 мин, фиксировалась в регистрационных картах и учитывалась при расчете фармакокинетических параметров. Введение препарата и отбор образцов крови в течение первых 60 мин осуществляли в положении лежа, через 120 и 180 мин - в положении сидя.
Образцы крови отбирались в дискретные интервалы времени до начала инфузии, через 1, 5 и 10 мин на фоне инфузии и после окончания инфузии через 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 120 и 180 мин, считая с момента начала введения препарата.
Кроме концентраций янтарной кислоты, рибоксина, никотинамида, рибофлавина мононуклеотида и рибофлавина определяли концентрации N-метилглюкамина, поскольку есть данные, свидетельствующие о потенцировании им транспорта активных компонентов Цитофлавина, и в первую очередь - янтарной кислоты, через клеточную мембрану внутрь клетки.
