Содержание к диссертации
Введение 6
Глава 1 Обзор литературы 10
Экспериментальные модели бронхиальной астмы (БА) у животных 10
Моделирование бронхиальной астмы у мышей 17
Краткосрочные модели БА 22
Долгосрочные модели БА 24
1.3 Практическое применение моделей БА на мышах 29
Изучение патогенеза БА 29
Использование моделей БА на мышах для доклинических исследований фармакологических препаратов 33
Изучение механизмов аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) и исследование новых форм лечебных аллергенов 35
Глава 2 Материалы и методы 40
Лабораторные животные 40
Аллергены и основные реагенты, использованные в работе 40
Способы и схемы иммунизации животных 41
Определение аллерген-специфического IgE методом пассивной кожной анафилаксии 47
Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ (ИФА) 47
Оценка системной анафилаксии у мышей с экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмой (ЭБА) и после экспериментальной АСИТ (ЭАСИТ) 48
Гистологическое исследование легких, клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) и периферической крови у мышей при моделировании ЭБА 49
Исследование клеточного состава периферической крови 49
Методика забора и оценки клеточного состава БАЛ у мышей 49
Гистологическое исследование легких 50
2.8 Методика оценки дыхательной функции мышей на введение
неспецифического и специфического раздражителей 51
Установка для регистрации пневмограмм у мышей 51
Регистрация пневмограмм 55
Анализ пневмограмм 55
2.9 Методы статистической обработки 56
Глава 3 Результаты собственных исследований 58
Оценка различных схем иммунизации ОА при моделировании аллергического воспаления в дыхательных путях мышей 58
Сравнение иммунологических и морфологических показателей при моделировании аллергического ответа в дыхательных путях мышей линии BALB/c и гибридов (СВА х C57BL/6)F1 60
Характеристика разработанной модели ЭБА у мышей 61
Динамика образования аллерген-специфических IgE антител 61
Оценка уровней суммарных аллерген-специфических IgG антител 63
Оценка реакции системной анафилаксии у мышей 64
Оценка клеточного состава периферической крови 66
Оценка клеточного состава БАЛ 68
Гистологическое исследование легких 73
Оценка неспецифической и специфической реактивности бронхов 82
3.4 Оценка ЭАСИТ модельным аллергеном овальбумином (ОА), химически
модифицированным сукцинилированием (сОА) и сОА в комплексе с
иммуномодулятором полиоксидонием (ПО) 90
Сравнительная оценка уровней аллерген-специфических IgE- и IgG-антител до, в течение и после ЭАСИТ 90
Сравнительная оценка клеточного состава периферической крови и БАЛ у мышей после ЭАСИТ 95
Сравнительная оценка морфологической картины легких у мышей после ЭАСИТ 100
Анализ пневмограмм мышей различных групп после ЭАСИТ 106
Сравнительная оценка выраженности системной анафилаксии у мышей после ЭАСИТ ...ПО
Глава 4 Обсуждение полученных результатов 112
Глава 5 Выводы 121
Список литературы 123
Перечень условных сокращений:
Ig - иммуноглобулин
Th - Т-хелпер
АСИТ - аллерген-специфическая иммунотерапия
AT - антитело
БА - бронхиальная астма
БАЛ - бронхо-альвеолярный лаваж
БСА - бычий сывороточный альбумин
ГР - гиперреактивность бронхов
ГІДА - гомоцитотропные антитела
ИЛ - интерлейкин
ИНФ-у - интерферон гамма
ИФА - иммуноферментный анализ
МТХ - метахолин
ОА - овальбумин
ОП - оптическая плотность
ПКА - пассивная кожная анафилаксия
ПО - полиоксидоний
сОА - сукцинилированный овальбумин
ТФР-р - трансформирующий фактор роста (3
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ЧД - частота дыхания
ЭАСИТ - экспериментальная аллерген-специфическая иммунотерапия
ЭБА - экспериментальная IgE-зависимая бронхиальная астма
Введение к работе
Бронхиальная астма (БА) является наиболее распространенным во всем мире хроническим заболеванием, представляющим значительную социальную проблему, как для детей, так и для взрослых. Очевидно, что за последние 20 лет распространенность этого заболевания заметно возросла, особенно среди детей [49]. По данным эпидемиологического исследования, проведенного в России, общее число больных БА приближается к 7 млн. человек [7]. В номенклатуре, представленной Европейской Академией Аллергологии и Клинической иммунологии, выделяют аллергическую (IgE-зависимая и не IgE-зависимая) и не аллергическую Б А [71]. В большинстве случаев, особенно у детей и молодых людей, развитие БА связано с IgE-опосредованными (атопическнми) механизмами [30]. Участие атопических механизмов доказано у 40% больных БА [114]. Представление о БА как о хроническом воспалительном заболевании дыхательных путей стало важным достижением и определило направление поиска терапевтических подходов для профилактики и контроля воспалительного процесса при БА. Несмотря на широкое применение различных противоастматических и противоаллергических фармакологических препаратов, отмечается повсеместный рост числа больных страдающих этим заболеванием, а также отмечается устойчивая тенденция к увеличению числа больных с тяжелыми формами БА [7].
На современном этапе медицинской науки значительная часть знаний о механизмах лежащих в основе того или иного заболевания получены с использованием экспериментальных моделей, адекватных различным заболеваниям человека. Исследования in vivo, также являются начальным и основополагающим этапом в изучении безопасности и эффективности новых лечебных препаратов. К настоящему времени, по данным зарубежной литературы, уже описаны протоколы индукции моделей бронхиальной астмы у животных, в частности у линейных мышей [17,42]. Большинство протоколов индукции IgE-зависимой бронхиальной астмы предполагает использование
адъювантов. Преимущественное использование мышей для моделирования бронхиальной астмы связано с большим разнообразием реагентов для изучения генетических и иммунных механизмов развития заболевания. Мыши могут быть сенсибилизированы к различным видам аллергенов и развивать аллерген-индуцированное воспаление в дыхательных путях, а также бронхиальную гиперреактивность. Существуют определенные сходства между параметрами моделей аллергической бронхиальной астмы мышей и характеристиками бронхиальной астмы человека, заключающиеся в морфологических изменениях дыхательных путей и ткани легких, в характере антительного ответа, а также участвующих в развитии и поддержании аллергического воспаления эффекторных клеток и молекул [25]. Анализ отечественной научно-практической литературы привел к заключению об отсутствии данных о разработке и использовании для доклинических исследований адекватной модели аллергической (IgE-зависимой) бронхиальной астмы у мышей. Поэтому, разработка экспериментальной модели бронхиальной астмы является актуальной и перспективной в нашей стране.
Разработка модели БА на мышах позволит в дальнейшем изучать механизмы, приводящие к развитию заболевания, оценивать безопасность и эффективность новых лечебных препаратов перспективных для лечения и профилактики БА.
Единственным к настоящему времени методом терапии аллергических
заболеваний атопической природы, воздействующего на все патогенетически
значимые звенья аллергического процесса и обладающего длительным
противоаллергическим эффектом, является аллерген-специфическая
иммунотерапия (АСИТ) [92]. В настоящее время разрабатываются и внедряются не только новые способы ее проведения, но и новые формы лечебных аллергенов. Такие аллергены должны обладать сниженной аллергенной и сохраненной иммуногенной активностью [4]. Это может быть достигнуто модификацией аллергенов, в том числе химической, а также использованием разнообразных природных и синтетических носителей - адъювантов [2,10,64].
Очевидно, что для доклинического изучения свойств гипоаллергенных вакцин и их терапевтической эффективности целесообразно использовать модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей. Проведение доклинических исследований новых форм аллергенов на модели ЭБА с использованием принципа АСИТ может всесторонне охарактеризовать влияние аллерговакцины на манифестацию и течение IgE-зависимой БА.
Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей и оценить возможность ее применения для доклинических исследований новых подходов к АСИТ.
Задачи:
Разработать схему моделирования IgE-зависимой БА у мышей путем введения модельного аллергена овальбумина (ОА) без использования адъюванта;
Изучить динамику накопления аллерген-специфических IgE- и IgG-антител в ходе моделирования ЭБА;
Провести оценку клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) и периферической крови у мышей с ЭБА;
Провести гистологическое исследование легких у мышей с ЭБА;
Оценить бронхиальную реактивность у мышей с ЭБА;
Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у мышей с ЭБА;
Провести сравнительную ЭАСИТ ^модифицированным, модифицированным (сукцинилированием) аллергеном и комплексом модифицированного аллергена с полиоксидонием на модели ЭБА;
Изучить динамику накопления аллерген-специфических IgE- и IgG-антител в ходе и позавершении ЭАСИТ;
Провести оценку клеточного состава БАЛ и периферической крови у мышей после ЭАСИТ;
10. Провести гистологическое исследование легких у мышей после ЭАСИТ;
11.Оценить бронхиальную реактивность у мышей после ЭАСИТ;
12.Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у
мышей после ЭАСИТ. Научная новизна работы:
Впервые в России разработана и охарактеризована краткосрочная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей без использования адъюванта.
Впервые в России проведено исследование дыхательной функции мышей в ответ на введение неспецифического раздражителя метахолина.
Впервые на модели IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей проведена экспериментальная аллерген-специфическая иммунотерапия химически модифицированным аллергеном.
Показано преимущество ЭАСИТ комплексом модифицированного аллергена и иммуномодулятора полиоксидония по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или немодифицированным аллергеном. Практическая значимость:
Разработанная краткосрочная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей позволит оценивать безопасность и эффективность новых форм лечебных аллергенов и фармакологических препаратов, перспективных для профилактики и лечения IgE-зависимых заболеваний, в частности атопической бронхиальной астмы.
Экспериментальная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы также может быть использована для изучения патогенетических механизмов лежащих в основе развития этого заболевания.
