Введение к работе
Актуальность темы. К настоящему времени накоплен немалый объем знаний о причинах возникновения и закономерностях развития бронхиальной астмы (БА) - одного из наиболее распространенных хронических неинфекционных заболеваний человека. Вплоть до начала 80-х годов XX века основным способом изучения этой нозологии были исследования с участием людей [GINA, 2006, Faul JL, 1997; Roche W.R., 1998] Благодаря им, в частности, удалось выявить патогенетическое значение хронического аллергического воспаления в ткани легких и связь большей части случаев БА с гиперпродукцией IgE-антител Однако, неустранимые этические и технические ограничения, свойственные такого рода исследованиям, не позволяли ответить на многие вопросы Это обстоятельство, а также трудности в создании новых классов противоастматических лекарственных средств, стимулировали поиск подходов к воспроизведению признаков заболевания у животных Оказалось, что введение аллергенов по определенным схемам приводит к развитию так называемой экспериментальной бронхиальной астмы (ЭБА) у крыс, морских свинок, овец, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов [Torres R, 2005] Важно подчеркнуть, что у каждого из перечисленных млекопитающих удается воспроизвести свой спектр признаков астмы, обязательными из которых являются спонтанная или индуцированная бронхиальная гиперреактивность, высокий уровень IgE-антител в крови, типичные морфологические изменения в ткани легких и изменения клеточного состава бронхоальвеолярного ла-важа Бурное развитие этого научного направления началось в середине 1990-х годов с момента первого описания модели БА на лабораторных мышах [Kung Т Т., 1994] Мышиная ЭБА отличается высоким уровнем сопоставимости с патологическими признаками заболевания человека, а сами животные хорошо доступны для изучения в связи с наличием разработанных подходов селекции, генной инженерии, молекулярной биологии, лаборатор-но-инструментальной диагностики. Помимо прочего важным оказалось и удобство работы с мышами, обусловленное относительно низкими затратами
на их содержание и питание и коротким репродуктивным циклом [Sugita М, 2003, Torres R., 2005].
Бы чо показано, что разные линии мышей различаются способностью реагировать на аллергены и развивать воспаление в тканях Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что одной из наиболее реактивных является чистая линия BALB/c, в то время как, например, С57ВЬ/6-мыши сенсибилизируются и провоцируются значительно хуже [Литвин Л С , 2006]
Для получения ЭБА наиболее часто используется овальбумин (ОА) -аллерген с хорошо известными структурой и свойствами. К настоящему моменту разработано несколько схем моделирования. Наиболее часто на первом этапе проводится 2-3-кратное интраперитонеальное введение аллергена через 2-4 дня в дозе по 10 мкг/мышь в комбинации с гидроксидом алюминия Последний используется в качестве адъюванта для усиления Тх2-ответа и аллергического воспаления в дыхательных путях Однако, как выяснилось, введение ОА в комбинации с алюмом вызывает появление обширных лимфоци-тарно-эозинофильных инфильтратов вокруг крупных бронхов, а инъекции монопрепарата аллергена индуцируют образование воспалительных очагов преимущественно около мелких бронхов [Epstein М М., 2006] Кроме того, не предполагается влияния адекватного по мощности адъюванта в процессе «естественной» сенсибилизации человека Поэтому все больший интерес привлекают безадьювантные модели, точнее имитирующие патогенез бронхиальной астмы и, в дополнение, позволяющие изучать влияние различных им-муномодулирующих агентов на маркеры заболевания [Крючков Н.А, 2008, Литвин Л С, 2007]. Тем не менее, воспроизведение ЭБА без применения адъювантов сопряжено со значительными трудностями и необходимостью подбора доз и кратности введения аллергена, достаточных для развития аллергического ответа, но не приводящих к развитию иммунологической толерантности В нашей стране выполнена серия работ, показавших действенность 7-кратных ежедневных или повторяющихся через день внутрибрю-шинных инъекций 10 мкг/мышь овальбумина [Литвин Л.С , 2007]. Через 2-3
недели после окончания интраперитонеальных или подкожных введений проводится провокация интраназальным введением ОА Повторный контакт с антигеном в условиях предрасположенности к Тх2-ответу вызывает развитие иммунного воспаления, IgE-переключение, эозинофильную инфильтрацию стенок бронхиального дерева и после многократной экспозиции приводит к бронхиальной гиперреактивности
В последние годы для модечирования БА стали использоваться причинно-значимые аллергены, в первую очередь, пыльцевые и пылевые [Крючков Н А, 2008, Kryuchkov N А, 2007, Kumar R.K, 2002; Torres R, 2005], вызывающие аллергическую патологию у человека в естественных условиях Данный подход особенно актуален в связи с необходимостью разработки новых технологий и схем антиген-специфической терапии (АСИТ) и предварительного изучения ее эффективности и безопасности на доклинических этапах Принципы воспроизведения ЭБА с использованием причинно-значимых алчергенов и овальбумина аналогичны Как правило, вначале проводится системная сенсибилизация, а после ее окончания - провокация путем доставки аллергена в воздухоносные пути В качестве аллергена могут выступать экстракты пыльцы ветроопыляемых растений и домашней пыли, а также экстрагированные или рекомбинантные сенсибилизирующие компоненты Эффективные дозы препаратов и схемы их введения различаются, однако предпочтительнее использовать малые количества аллергенов в отсутствие адъю-вантов Уже получены мышиные модели с сенсибилизацией к аллергенам домашней пыли [Arm J Н, 2007, McKmley L, 2004], маслины [Conejero L., 2007], пыльцы амброзии [Wild J S, 2000] и березы [Daniel С , 2006] Однако перечень причинно-значимых сенсибилизирующих агентов, изученных на предмет способности вызывать ЭБА-подобные изменения, пока чрезвычайно ограничен
Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную безадъ-ювантную модель бронхиальной астмы на лабораторных мышах линии
BALB/c с использованием аллергенного экстракта пыльцы тимофеевки полевой
Задачи исследования.
1 Разработать оптимальную схему моделирования экспериментальной бронхиальной астмы у мышей путем введения экстракта пыльцы тимофеевки в отсутствие адъюванта
-
Изучить динамику накопления аллерген-специфических гомоцитотроп-ных IgE-антител в крови мышей в ходе моделирования бронхиальной астмы
-
Провести оценку гистологических изменений легких мышей при моделировании БА
-
Разработать и провести первичную проверку применимости полуколичественной системы анализа гистологических изменений легких мышей с экспериментальной бронхиальной астмой
-
Оценить изменения относительного клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.
-
Оценить изменения лейкоцитарной формулы периферической крови у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой
-
Провести пневмотахографическую оценку функции внешнего дыхания у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой
Научная новизна. Впервые в мире разработана и охарактеризована краткосрочная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергенного экстракта пыльцы тимофеевки полевой у мышей без использования адъюванта Полученная модель ЭБА характеризуется развитием ранней и поздней фазы аллергического ответа в дыхательных путях, повышением аллерген-специфических IgE-антител в периферической крови, выраженной гиперреактивностью бронхов на воздействие неспецифического бронхо-констриктора метахолина. Данные признаки адекватны патологическим из-
менениям, характерным для острого воспаления при атопической бронхиальной астме человека
Впервые предложен метод полуколичественного анализа гистологических изменений легких мышей при моделировании бронхиальной астмы
Практическая значимость. Разработанная модель БА на лабораторных мышах может использоваться для оценки эффективности и безопасности потенциальных лекарственных средств или их форм в процессе лечения и профилактики заболевания на доклиническом этапе, Особое значение имеет возможность применения данной модели для нахождения новых подходов к антиген-специфической терапии модифицированными аллергенами пыльцы тимофеевки
Предложенная модель может применяться и при изучении патогенетических механизмов развития бронхиальной астмы
Полученные данные могут быть использованы в образовательном процессе на додипломном этапе высшего медицинского образования и в учебных программах повышения квалификации специалистов по аллергологии и иммунологии
Апробация работы. Результаты исследования докладывались на VIII Российском конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (27-29 июня 2007 г., Москва, Россия), И Международном конгрессе «Иммунитет и болезни» (10-14 сентября 2007 г, Москва, Россия) XXVII конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии (7-11 июня 2008 г, Барселона, Испания). Основные результаты диссертационной работы отражены в 6 публикациях
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа построена по традиционному плану, изложена на 125 страницах машинописного текста Состоит из введения, обзора литературы, разделов, описывающих материалы и методы исследований, результаты, обсуждения полученных результатов и выводов Диссертация иллюстрирована 11 таблицами, 26 рисунками,
включая фотографии. Список использованной литературы включает 153 источника из них 16 отечественных и 137 зарубежных
