Определение функциональной активности компонентов C2, C3 и факторов B и D комплемента человека Романов Сергей Владимирович

Содержание к диссертации

ВВЕДЕНИЕ 6

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

ГЛАВА 1. СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА 10

1.1. АКТИВАЦИЯ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА 10

1. Механизм активации классического пути 11

2. Механизм активации альтернативного пути 1<4

3. Сравнение классического и альтернативного путей активации 17

4. Регуляция системы комплемента 17

2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА 19

3. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ СЗ/С5 - КОНВЕРТАЗ 22

1. Конвертазы классического пути . 22

2. Конвертазы альтернативного пути 23

3. Ингибирование образования С5-конвертаз 24

ГЛАВА 2. КОМПОНЕНТЫ И ФАКТОРЫ СИСТЕМЫ
КОМПЛЕМЕНТА 28

2.1. СЗ - КЛЮЧЕВОЙ УЧАСТНИК АКТИВАЦИИ 28

4. Биологическая роль СЗ компонента и его фрагментов 31

5. Способы выделения компонента СЗ 32

6. Дефициты СЗ 33

2.2. КОМПОНЕНТ С2 - КАТАЛИТИЧЕСКАЯ СУБЪЕДИНИЦА СЗ/С5-КОНВЕРТАЗ
КЛАССИЧЕСКОГО ПУТИ 35

2.2.1, Биологические функции С2 компонента 35

2.2.2. Генетика С2 компонента 36

2,2.3 Дефициты С2 38

2.3. ФАКТОР В 39

7. Ферментативные свойства фактора В 44

8. Дефициты фактора В (BiD) 45

2.4. ФАКТОР D 46

2.4.1 .Ферментативные свойства фактора D 46

2.4.2. Дефициты фактора D (DfD) 48

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 50

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 50

3.1. ОБСЛЕДОВАННЫЕ ГРУППЫ ЛИЦ 50

2. МАТЕРИАЛЫ 50

3. ПРОЧИЕ МАТЕРИАЛЫ 51

4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ И ПРОЧИХ РАБОЧИХ СРЕД 51

5. ОБЩИЕ МЕТОДЫ 54

1. Иммунизация животных 54

2. Иммунопреципитация по Оухтерлони 54

3. Иммуноэлектрофорез(ИЭФ) в модификации по Шейреггеру 54

4. Определение концентрации СЗ методом радиальной иммунодиффузии (РИД) 55

5. Приготовление реагента R2 55

6. Приготовление R3 55

7. Получение конъюгата к СЗ человека 56

8. Определение количества компонента СЗ методом ИФА 57

3.6. МЕТОДИКИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ 58

9. Получение иммунохимически чистого СЗ человека 58

10. Выделение IgG фракции из кроличьей акти сыворотки 58

11. Выделение IgG3 из миеломной сыворотки человека 59

12. Выделение IgA из миеломной сыворотки человека 59

13. Выделение СЗ из сыворотки морской свинки 60

14. Выделение фактора D и получение RD 60

3.7. ГЕМОЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 61

15. Эритроциты барана 61

16. Приготовление стандартной взвеси бараньих эритроцитов 61

17. Приготовление сенсибилизированных эритроцитов 61

18. Приготовление комплекса ЕАС14 61

19. Определение активности компонентов гемолитическим методом 61

20. Получение эритроцитов кролика 62

21. Определение активности фактора D гемолитическим методом 62

22. Определение активности участников альтернативного пути гемолитическим методом 62

3.8. СОБСТВЕННЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАЗРАБОТКИ 63

23. Определение активности СЗ по классическому пути 63

24. Ингибирование функциональной активности СЗ компонента 64

25. Определение активности С2 65

26. Определение активности СЗ по альтернативному пути 66

27. Определение активности фактора В 67

28. Определение активности фактора D 67

29. Исследование действия на комплемент человека CVF из

Naja naja, Naja haja и Naja mclanoleyca. 68

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 70

4.1. ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТА ПРОТИВ КОМПОНЕНТА СЗ ЧЕЛОВЕКА И
ПРОВЕРКА ЕГО СПЕЦИФИЧНОСТИ 70

30. Определение разведения конъюгата 71

31. Анализ количества СЗ в образцах сывороток 72

4.2. РАЗРАПОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА АКТИВНОСТЕЙ КОМПОНЕНТОВ
КЛАССИЧЕСКОГО ПУТИ 74

32. Разработка метода анализа функциональной активности СЗ , 74

33. Исследование процесса ингибирования образования С5-конвертазы 77

34. Определение активности С2 80

4.3. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТЕЙ
УЧАСТНИКОВ АЛЬТЕРНАТИВНОГО ПУТИ 83

1. Выбор активатора альтернативного пути 83

2. Определение активности СЗ по альтернативному пути 85

3. Определение активности фактора В 87

4. Определение активности фактора D 90

5. Исследование лейстсия на комплемент человека CVF из

Naja naja, Naja naja и Naja melanoleyca 93

4.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА СЗ В
СЫВОРОТКАХ С НАЛИЧИЕМ И ОТСУТСТВИЕМ АНТИТЕЛ К РАЗЛИЧНЫМ
ВОЗБУДИТЕЛЯМ 95

4.4.1. Обследуемые группы с наличием и отсутствием AT к вирусу герпеса 96

4.4.2,Обслсдуемые группы с наличием и отсутствием AT xChUrachomatis 97

4.4.2, Влияние возраста па активность компонента СЗ в сыворотке крови 100

ВЫВОДЫ 104

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105

*

Список сокращений

(русскоязычные сокращения)

АГ-антиген;

Л К - аминокислота, аминокислотный остаток;

АП -альтернативный путь активации комплемента;

AT - антитело;

АЦ-активный центр фермента;

ВВС —веронал-мединаловый буфер;

ВВС ⁺- веронал-мединаловый буфер с ионами Са и Mg ⁺;

В БС-Мц-ЭГТА —веронал-мединаловый буфер с ионами Mg²⁺ и ЭГТЛ;

ГМА - гемолитический метод анализа;

ЗФР -забуференный физиологический раствор;

ИС - иммунная система;

ИФА - иммуноферментный метод анализа;

КП - классический путь активации комплемента;

ЛП - пектиновый путь активации комплемента;

М — молярность;

МАК -мембраноатакуюший комплекс;

ПХ - пероксидаза хрена;

РИД - радиальная иммунодиффузия;

СК - система комплемента;

(англоязычные сокращения) ЕА - сенсибилизированные эритроциты барана; Ml 1С — major histocompatibility complex (главный комплекс гистосовместимости).

Введение к работе

Актуальності, проблемы. Исследования, проводимые в лаборатории молекулярной иммунологии, посвящены разработке современных методов определения функциональной активности компонентов и факторов комплемента человека и применению этих методов для клинических исследований различных заболеваний инфекционной и аутоиммунной природы. Данная работа является частью этих исследований и состоит из разработки иммуноферментных методов определения функциональной активности компонентов С2, СЗ и факторов В и D комплемента человека и использованию этих методов для исследования механизмов действия комплемента и для клинических исследований.

Современные знания об участии комплемента в заболеваниях человека и его биологическом значении в иммунной защите тесно связаны с прогрессом лабораторных диапюстических методов анализа комплемента, поскольку комплемент играет решающую роль в патогенезе различных заболеваний. При этом наибольшую диагностическую ценность представляет определение функциональной активности компонентов системы комплемента по сравнению с их количественным содержанием. Это обусловлено, прежде всего, изменением скорости обновления компонентов комплемента, определяемой соотношением процессов биосинтеза и катаболизма, которое нарушается при многих, главным образом, аутоиммунных заболеваниях.

Компоненты С2, СЗ и факторы В, D играют непосредственную роль в формировании С5-конвертаз классического и альтернативного путей. Процесс формирования С5-конвсртаз обусловливает силу иммунного ответа и воспалительной реакции. Поэтому большой практический интерес представляет анализ функциональной активности этих белков.

Цель исследовании.

Определить функциональную активность компонентов С2, СЗ и факторов В, D иммуноферментпыми методами анализа. Изучить ингибирующее и активирующее действия ряда веществ па комплемент.

Задачи исследования. разработать иммуноферментные методы определения активных форм компонентов С2 и СЗ при инициации классического пути; найти удобные и применимые активаторы альтернативного пути для разрабатываемых методов; разработать иммуноферментные методы определения активностей компонента СЗ и факторов В и D при инициации альтернати иного пути; разработать методы анализа для оценки действия веществ, активирующих и ипгибирующих систему комплемента; показать применимость разработанных методов для клинических целей и лабораторных исследований.

Научная новизна результатов исследовании. разработаны иммуноферментные методы анализа активных форм компонентов СЗ, С2 при инициации классического пути системы комплемента (получено 2 патента РФ и подана одна заявка на получение патента); разработаны иммуноферментные методы анализа активности компонента СЗ и факторов В, D при запуске альтернативного пути системы комплемента (поданы три заявки на получение патентов РФ); разработан способ определения ипгибируюіцего действия различных эффекторов на систему комплемента при образовании С5-конвертазы классического пути (получен патент РФ); с помощью разработанного метода обнаружено декомплемептнзируютее действие CVF (фактора яда кобры) Naja melunoleuca и показано его количественное отличие от действия фактора яда других видов кобр; определена активность компонента СЗ у пациентов с наличием и отсутствием антител к вирусу герпеса и Chi trachomatis.

Практическая значимость результатов исследований

1) Разработаны иммуноферментные методы определения функциональной активности компонентов С2, СЗ и факторов В и D комплемента, которые пригодны для применения в клинике.

Предложен способ определения ингибируюшего действия веществ на систему комплемента на стадии образования С5-конвертазы, что может быть использовано для оценки противовоспалительного действия лекарственных веществ и иммуногсішости вакцин.

Предложен способ определения способности веществ активировать альтернативный путь комплемента. Этот способ может найти применение для лабораторных исследований свойств лекарственных веществ и адъювантов.

Практическая ценность работы подтверждена в трех патентах РФ: «Способ определения ингибируюшего действия веществ на комплемент» (№2195665/С2 от 27.12.2002), «Способ определения функциональной активности компонента СЗ комплемента человека» (№2195664/С2 от 27.12.2002), «Способ определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека» (№2195670/С1 от 27.12,2002). Подано четыре заявки на получение патентов РФ: «Способ определения функциональной активности компонента СЗ комплемента человека по альтернативному пути активации» (Заявка на патент РФ. № 2003110060 от 09.04.03.), «Способ определения функциональной активности фактора В комплемента человека» (Заявка на патент РФ № 2003110061 от 09.04.03.), «Способ определения функциональной активности фактора D комплемента человека» (Заявка на патент РФ № 2003110059 от 09.04.03.), «Способ определения функциональной активности компонента СЗ комплемента человека по классическому пути активации» (Заявка на патент РФ № 2003135511 от 09.12.03.).

Положения, выносимые на защиту:

Разработаны иммуноферментные методы оценки функционально активных форм компонентов СЗ, С2 при инициации классического пути системы комплемента.

Разработаны методы иммуноферментного определения функциональных активностей компонента СЗ и факторов В и D при инициации альтернативного пути комплемента.

Разработан метод анализа и исследованы комплемент-ингибируюшне свойства веществ на стадии образования С5-конвертазы классического пути. Разработан метод анализа и исследована ком нлемент-акти вирую іцая способность различных веществ при инициации альтернативного пути. Таким образом, показана применимость разработанных методов для лабораторных исследований механизмов функционирования системы комплемента. 4) Проведены анализы активности компонента СЗ в группах людей с наличием и отсутствием антител к вирусу герпеса и СМ. trachomatis, показана применимость разработанных методов для клинических анализов.

Публикации. Материалы по теме диссертации были представлены в 14 публикациях.

Апробации работы. Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на: международной конференции БИОКАТАЛИЗ-2000 {Москва, июнь 2000 г.), V симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, апрель 2002), международной конференции «Цитокины, воспаление, иммунитет» (Санкт-Петербург, июнь 2002), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, сентябрь 2003), научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты эптерального и внутривенного применения» (Москва, декабрь 2003).

Похожие диссертации на Определение функциональной активности компонентов C2, C3 и факторов B и D комплемента человека

Использование моноклональных антител к IgE для изучения антигенной структуры молекулы IgE человека и определения уровня общего IgE и аллергенспецифических IgE антителСмирнова, Елена Яновна

Оптимизация промышленного производства анти-А и анти-В моноклональных антител для определения групп крови человека системы АВ0Проскурина, Наталья Владимировна

Получение иммунохимических реагентов для определения Сl-ингибитора и Clq компонетов системы комплемента человека и некоторые аспекты их клинического примененияРозина, Марина Николаевна

Разработка иммуноферментных тест-систем для количественного определения IgG-, IgG4-антител и их выявления при аллергической патологии человекаАгафонов, Виктор Евгеньевич

Функциональная активность Т-компонента иммунитета in vitro в пожилом и старческом возрастеОсадзе, Манана Валерьяновна

Маркеры ретровирусов типа D при В-клеточных лимфоаденопатиях человекаКжышковска, Юлия Георгиевна

Изменения экспрессии факторов роста эндотелия сосудов VEGF-C и VEGF-D и их рецепторов в некоторых злокачественных новообразованиях человекаШишкин Александр Алексеевич

Общепатологическая и судебно-медицинская оценка возрастных изменений кожи для определения возраста человекаСавенкова Екатерина Николаевна

Комплексное исследование тел поясничных позвонков для определения пола и возраста человекаЭрлих, Эдвин Роландович

Клинико-диагностическое значение определения иммуноглобулинов в сыворотке крови человека с использованием фотохимического взаимодействия белков с п-диметиламинобензальдегидомНикитенко Екатерина Александровна